Реферат: Питательные субстраты, применяемые в биотехнологии

Питательные субстраты, применяемые в биотехнологии.

Биосинтез пенициллинов методами ферментации в 1940-х годах ознаменовал собой начало эры промышленной биотехнологии. Общий объем биотехнологической продукции сегодня в мире измеряется в миллионах тонн в год. Любое производство начинается с сырья.

Сырье в биотехнологических производствах, особенно крупнотоннажных, занимает первое место в статьях расходов и составляет 40-65% общей стоимости продукции. При тонком биосинтезе доля сырья в общей себестоимости продукции уменьшается.

Выбор между биосинтезом и химическим синтезом вещества определяется экономическими факторами. Вот почему такую важность имеет цена сырья.

При химическом синтезе сырьем служит нефть или ее производные. При биосинтезе сырьем обычно являются крахмал, целлюлоза или побочные продукты пищевой промышленности (меласса, молочная сыворотка и пр.).

Эффективность процесса составляют следующие факторы:

1.количество субстрата, превращаемого в конечный продукт;

2.длительность синтеза;

3.стоимость отделения продукта от культуральной среды;

4. стоимость уничтожения отходов или побочных продуктов производственного процесса или
их возможное использование.

Питательный субстрат, или питательная среда, является сложной трехфазной системой, содержащей жидкие, твердые и газообразные компоненты.

Существует тесное взаимодействие между культивируемым объектом и физико-химическими факторами среды. В принципе, микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для промышленной биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ.

Органическое сырье без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза. Тем не менее, целлюлозосодержащее сырье после химического или ферментативного гидролиза и очистки может быть использовано в биотехнологическом производстве.

Из органического сырья наибольшее внимание биотехнологов привлекает крахмал, хотя для его ассимиляции микроорганизмами требуется сложный комплекс амилолитических ферментов, которыми владеют только некоторые виды микроорганизмов. Много крахмала расходуется для производства этанола, а также для приготовления фруктозных сиропов. Однако запасы крахмалсодержащего сырья ограниченны, поэтому используют мелассу, метанол, этанол и глюкозное сырье. При выборе сырья необходимо учитывать не только физиологические потребности выбранного продуцента, но и стоимость сырья.

Углеродсодержащее сырье является основным сырьем микробного синтеза. К нему относятся парафиновые углеводороды нефти, метан как компонент природного газа, гидролизаты растительного сырья, этанол, уксусная кислота и т.д. Низкомолекулярные спирты (метанол и этанол) можно отнести к циклу перспективных видов микробиологического сырья, так как их ресурсы существенно увеличиваются благодаря успешному развитию технологии химического синтеза. Примером использования побочных продуктов является крахмальный экстракт, сульфитный щелок, зерновая и картофельная барда, меласса, молочная сыворотка и т.д.

Характеристика основных видов сырья .

Распространенными источниками углерода и энергии являются компоненты нефти и природного газа. В состав сырой нефти входят парафиновые, нафтеновые и ароматические углеводороды с большей или меньшей примесью кислородсодержащих или сернистых соединений.

В зависимости от месторождения соотношение в нефти различных классов углеводородов варьирует.

В наиболее распространенных сортах нефти содержится 50-60% нафтенов, 20-30% парафинов и 15-30% ароматических углеводородов. Каждый класс углеводородов представлен многочисленными гомологами и изомерами. Это обуславливает необходимость разделения нефти на фракции, что достигается путем ее перегонки или крекинга (превращения длинноцепочечных углеводородов в короткоцепочечные).

Дизельная фракция (продукт переработки нефти) содержит не менее 15% парафинов и является источником парафиновых углеводородов, которые по структуре и молекулярной массе оптимальны для потребления бактериями и дрожжами

Выделение парафинов из дизельной фракции осуществляют методами карбамидной депарафинизации или адсорбционного извлечения.

Полученные жидкие парафины пригодны для культивирования микроорганизмов и имеют следующий состав (в %):

1.п-алканы (парафиновые углеводороды) с числом углеродных атомов от 10 до 20 - 98%

2.ароматические углеводороды - 0,2%

3.сера - 0,05%,

Практически все сказанное о нефти относится и к природному газу - сложной смеси органических (углеводороды и их производные) и неорганических веществ. Концентрация метана в природном газе может приближаться к 100%.

Вместе с тем круг метанотрофов - микроорганизмов, способных непосредственно утилизировать метан, сравнительно ограничен.

Используемый природный газ требует перед подачей в ферментер дополнительной очистки от соединений, сильно ингибирующих рост клетки. Ограниченность ресурсов нефти и газа вынуждает биотехнологов изыскивать иные, в первую очередь возобновляемые источники сырья.

В этой связи большое внимание уделяют различным видам растительной массы: плодам, сокам, клубням, травяной массе, древесине. Применяют отходы сельского хозяйства, деревообрабатывающей и бумажной промышленности, что позволяет реализовать с помощью биотехнологии принцип безотходного производства.

Половину высушенной растительной биомассы составляет целлюлоза - самый распространенный биополимер. Как полисахарид целлюлоза представляет собой ценный источник углерода и энергии. Химический состав растительного сырья неодинаков.

Главной частью растительного сырья являются полисахариды (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества) - 40-75% и лигнин- от 15 до 60%.

Лигнин- нерастворимый при гидролизе остаток растительного сырья- находит ограниченное применение и является балластом.

Основным способом гидролиза растительного сырья является перколяционный гидролиз серной кислотой при повышенных давлении и температуре.

По этому способу горячая разбавленная кислота (жидкая фаза) непрерывно протекает через слой неподвижной твердой фазы (измельченное растительное сырье), которая полностью погружена в жидкость.

В гидролизатах основной примесью, подавляющей обмен веществ, рост и развитие микроорганизмов, являются фурфурол (выше 0,02%) и оксиметилфурфурол (выше 0,1%).

Для получения биологически доброкачественных гидролизатов осуществляют дальнейшую обработку, включающую в себя нейтрализацию кислот, отделение осадков и коллоидных частиц, охлаждение до 30°С, удаление вредных летучих примесей.

Основными недостатками процесса гидролиза древесины являются образование крупнотоннажного отхода - лигнина и низкое качество гидролизата с точки зрения микробиологического синтеза.

В настоящее время интенсивно разрабатываются более совершенные процессы гидролиза растительного сырья.

Перспективным направлением является ферментативный гидролиз целлюлозы.

Основным источником этанола является нефтехимический синтез.

Известны также промышленные способы получения других подобных продуктов.

«Гидролизный спирт» получают путем сбраживания гексоз, содержащихся в гидролизатах растительного сырья.

«Пищевой» этанол- образуется в процессе брожения моносахаридов при ферментативном гидролизе крахмала.

Производство синтетического этилового спирта основано на сернокислотной гидратации этилена или прямой гидратации этилена водяным паром. Для получения товарного продукта этанол-сырец подается на ректификацию.

Полученный этанол в виде азеотропа (96% этанола и 4% воды) с минимальным содержанием ингибирующих примесей (не более 0,005%) является готовым субстратом для культивирования микроорганизмов.

В последние годы установлено, что уксусная кислота представляет собой очень перспективный субстрат для биотехнологии: на ней хорошо развиваются дрожжи как источник микробного белка, однако наиболее интересно применение уксусной кислоты в биосинтезе лизина.

Ввиду необходимости использования в качестве субстрата большого количества уксусной кислоты целесообразно получение ее каким-либо крупнотоннажным способом, в частности химическим синтезом из этилена через ацетальдегид или карбонилированием метанола.

Пищевая уксусная кислота издавна получается путем окисления этанола культурами бактерии рода Acetobacter.

Меласса, содержит до 50% сахарозы, является отходом сахарного производства и очень широко используется в микробиологическом синтезе, так как многие продуценты белка и биологически активных веществ прекрасно утилизируют углеводы из мелассы.

Поступающая на свеклосахарный завод свекла проходит очистку, затем подается на свеклорезку, где изрезывается в стружку. Полученная свекловичная стружка подается в емкости для набухания и экстракции диффузионного сока. После фильтрации диффузионный сок подается на выпарную установку, где сгущается до содержания сухих веществ 60-65%. Дальнейшее сгущение сиропа до содержания сухих веществ 95-98% осуществляется в вакуум-аппарате (кристализация сахарозы). Вязкая жидкость - меласса в качестве отхода производства отправляется на склад

Субстраты для культивирования микроорганизмов с целью получения белка

В качестве источников вещества и энергии микроорганизмы используют самые разнообразные субстраты - нормальные парафины и дистилляты нефти, природный газ, спирты, растительные гидролизаты и отходы промышленных предприятий.

Для выращивания микроорганизмов с целью получения белка хорошо бы иметь богатый углеродом, но дешевый субстрат. Этому требованию вполне отвечают нормальные (неразветвленные) парафины нефти. Выход биомассы может достигать при их использовании до 100% от массы субстрата. Качество продукта зависит от степени чистоты парафинов. При использовании парафинов достаточной степени очистки, полученная дрожжевая масса может успешно применяться в качестве дополнительного источника белка в рационах животных. Первый в мире крупный завод кормовых дрожжей мощностью 70 000 т. в год. был пущен в 1973 г. в СССР. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы и несколько видов дрожжей, способных к быстрому росту на углеводородах: Candida maltosa, Candida guilliermondii, Candida lipolytica. В дальнейшем именно отходы от переработки нефти служили главным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 80-х гг. превысило 1 млн. т. в год, причем в СССР кормового белка получали вдвое больше, чем во всех остальных странах мира, вместе взятых. Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко сократились. Это произошло как в результате экономического кризиса 90-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них - необходимость очистки готового кормового продукта от остатков нефти, имеющих канцерогенные свойства.

В нашей стране мало районов, пригодных для выращивания сои, являющейся основным источником белковых добавок. Поэтому налажено крупнотоннажное производство кормовых дрожжей наn-парафинах. Действует несколько заводов мощностью от 70 до 240 тыс. тонн в год. Сырьем служат жидкие очищенные парафины.

Одним из перспективных источников углерода для культивирования продуцентов белка высокого качества считается метиловый спирт. Его можно получать методом микробного синтеза на таких субстратах, как древесина, солома, городские отходы. Использование метанола в качестве субстрата затруднено из-за его химической структуры: молекула метанола содержит один атом углерода, тогда как синтез большинства органических соединений осуществляется через двухуглеродные молекулы. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Наилучшими продуцентами на этом субстрате считаются бактерии, потому что они могут расти на метаноле с добавлением минеральных солей. Процессы получения белка на метаноле достаточно экономичны. По данным концерна Ай-Си-Ай (Великобритания), себестоимость продукта, производимого на метаноле, на 10-15% ниже, чем при аналогичном производстве, базирующемся на основе высокоочищенных n-парафинов. Высокобелковые продукты из метанола получают фирмы ряда развитых стран мира: Великобритании, Швеции, Германии, США, Италии. Продуцентами белка служат бактерии рода Methylomonas. Выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilus methylotrophus, выгодно, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. При росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот - дегидрогеназой. Ведутся генно-инженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.

Использование этанола как субстрата снимает проблему очистки биомассы от аномальных продуктов обмена с нечетным числом углеродных атомов. Стоимость такого производства несколько выше. Биомассу на основе этанола производят в Чехословакии, Испании, Германии, Японии, США.

В США, Японии, Канаде, ФРГ, Великобритании разработаны технологические процессы получения белка на природном газе. Выход биомассы в этом случае может составлять 66% от массы субстрата. В разработанном в Великобритании процессе используется смешанная культура: бактерии Methylomonas, усваивающие метан, Hypomicrobium и Pseudomonas, усваивающие метанол, и два вида неметилотрофных бактерий. Культура характеризуется высокой скоростью роста и продуктивностью. Главные достоинства метана (кстати сказать, основного компонента природного газа) - доступность, относительно низкая стоимость, высокая эффективность преобразования в биомассу метаноокисляющими микроорганизмами, значительное содержание в биомассе белка, сбалансированного по аминокислотному составу. Бактерии, растущие на метане хорошо переносят кислую среду и высокие температуры, в связи с чем устойчивы к инфекциям.

Субстратом для микробного синтеза может быть и минеральный углерод - углекислый газ. Окисленный углерод в данном случае с успехом восстанавливается микроводорослями при помощи солнечной энергии и водородоокисляющими бактериями при помощи водорода. На корм скоту используют суспензию водорослей. Для работы установок по выращиванию водорослей необходимы стабильные климатические условия - постоянные температуры воздуха и интенсивность солнечного света.

Наиболее перспективно получение белка с помощью водородоокисляющих бактерий, которые развиваются за счет окисления водорода кислородом воздуха. Энергия, высвобождающаяся в этом процессе, идет на усвоение углекислого газа. Для получения биомассы используются, как правило, бактерии рода Hydrogenomonas. Первоначально интерес к ним возник при разработке замкнутых систем жизнеобеспечения, а затем их стали изучать с точки зрения использования в качестве продуцентов высококачественного белка. В институте микробиологии Геттингенского университета (Германия) разработан способ культивирования водородоокисляющих бактерий, при котором можно получать 20 г сухого вещества на 1 литр суспензии клеток. Возможно, в будущем эти бактерии станут основным источником пищевых микробных белков.

Исключительно доступным и достаточно дешевым источником углеводов для производства микробного белка является растительная биомасса. Любое растение содержит разнообразные сахара. Целлюлоза - полисахарид, состоящий из молекул глюкозы. Гемицеллюлоза состоит из остатков арабинозы, галактозы, маннозы, фруктозы. Проблема в том, что полисахариды древесины связаны жесткими оксифенилпропановыми звеньями лигнина - полимера, почти не поддающегося разрушению. Поэтому гидролиз древесины происходит только в присутствии катализатора - минеральной кислоты и при высоких температурах. При этом образуются моносахара - гексозы и пентозы. На жидкой, содержащей сахара, фракции гидролизата выращивают дрожжи. При кислотном гидролизе древесины образуется ряд побочных продуктов (фурфурол, меланины), а из-за высоких температур может произойти карамелизация сахаров. Эти вещества препятствуют нормальному росту дрожжей, их отделяют от гидролизата и по возможности используют. В качестве продуцентов используют штаммы Candida scotti и C.tropicalis.

Наиболее крупным производителем сырья для гидролизной промышленности являются деревообрабатывающие предприятия, отходы которых достигают ежегодно десятки миллионов тонн. К сожалению, нерационально или не используются вообще отходы производства лубяных волокон (из льна и конопли), картофелекрахмального производства, пивоваренной, плодоовощной, консервной промышленности, свекловичный жом.

Особого внимания заслуживают способы прямой биоконверсии продуктов фотосинтеза и их производных в белок с помощью грибов. Эти организмы благодаря наличию мощных ферментных систем способны утилизировать сложные растительные субстраты без предварительной обработки. Исследования условий биоконверсии растительных субстратов в микробный белок активно ведутся в США, Канаде, Индии, Финляндии, Швеции, Великобритании, в нашей стране и других странах мира. Однако в литературе сведения о широкомасштабном производстве белков микробного происхождения немногочисленны. Наиболее известным и доведенным до стадии промышленной реализации является процесс "Ватерлоо", разработанный в университете Ватерлоо в Канаде. Это процесс, основанный на выращивании целлюлозоразрушающих грибов Chaetomium cellulolyticum, можно осуществлять как в глубинной культуре, так и поверхностным методом. Содержание белка в конечном продукте (высушенном грибном мицелии) составляет 45%. Финская фирма "Тампелла" разработала технологию и организовала производство белкового кормового продукта "Пекило" на отходах целлюлозно-бумажного производства. Продукт содержит до 60% протеина с хорошим аминокислотным профилем и значительное количество витаминов группы В.

В большинстве стран - производителей молока традиционным способом утилизации сыворотки является скармливание её животным. Степень конверсии белка сыворотки в белок животного весьма невысока (для выработки 1 кг животного белка необходимо 1700 кг сыворотки). В последние 10-15 лет из сыворотки методом ультрафильтрации выделяют белки высокого качества, на основе которых делают заменители сухого обезжиренного молока и другие продукты. Концентраты можно использовать как пищевые добавки и компоненты детского питания. Из сыворотки производится и молочный сахар - лактоза, применяемая в пищевой и медицинской промышленности. При всем при этом объем промышленной переработки сыворотки составляет 50-60% от её общего производства. Следовательно, налицо большие потери ценнейшего молочного белка и лактозы. Более того, возникает проблема утилизации отходов, так как процесс естественного разложения сыворотки происходит крайне медленно. Лактоза молочной сыворотки может служить источником энергии для многих видов микроорганизмов, сырьем для производства продуктов микробного синтеза (органических кислот, ферментов, спиртов, витаминов) и белковой биомассы. Из всех известных микроорганизмов самым высоким коэффициентом конверсии белка сыворотки в микробный белок обладают дрожжи. Способность к ассимиляции лактозы имеется примерно у 20% всех известных видов дрожжей. Гораздо реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу. Активный катаболизм лактозы особенно характерен для дрожжей из рода Kluyveromyces. Эти дрожжи можно использовать для получения на молочной сыворотке кормового белка, этанола, препаратов β-глюкозидазы.

Впервые дрожжи на молочной сыворотке стали выращивать в Германии. В качестве продуцентов применяли различные штаммы сахаромицетов. Разработаны способы получения микробных продуктов, основанные на использовании лактозы как монокультурой, так и смесью дрожжей и бактерий. В настоящее время в качестве продуцентов используют дрожжи родов Candida, Trichosporon, Torulopsis. Молочная сыворотка с выросшими в ней дрожжами по биологической ценности значительно превосходит исходное сырье и её можно использовать в качестве заменителя молока. Приведенный перечень микроорганизмов и процессов получения белка одноклеточных не является исчерпывающим. Однако потенциал этой новой отрасли производства используется далеко не полностью. Кроме того, мы еще не знаем всех возможностей деятельности микроорганизмов в качестве продуцентов белка, но по мере углубления наших знаний, они будут расширены.

Субстраты для культивирования микроорганизмов – отходы промышленных предприятий.

Субстраты для культивирования микроорганизмов - растительные гидролизаты.

Особого внимания заслуживают способы прямой биоконверсии продуктов фотосинтеза и их производных в белок с помощью грибов. Эти организмы благодаря наличию мощных ферментных систем способны утилизировать сложные растительные субстраты без предварительной обработки. Исследования условий биоконверсии растительных субстратов в микробный белок активно ведутся в США, Канаде, Индии, Финляндии, Швеции, Великобритании, в нашей стране и других странах мира. Однако в литературе сведения о широкомасштабном производстве белков микробного происхождения немногочисленны. Наиболее известным и доведенным до стадии промышленной реализации является процесс Ватерлоо , разработанный в университете Ватерлоо в Канаде. Это процесс, основанный на выращивании целлюлозоразрушающих грибов Chaetomiumcellulolyticum, можно осуществлять как в глубинной культуре, так и поверхностным методом. Содержание белка в конечном продукте (высушенном грибном мицелии) составляет 45%. Финская фирма Тампелла разработала технологию и организовала производство белкового кормового продукта Пекило на отходах целлюлозно-бумажного производства. Продукт содержит до 60% протеина с хорошим аминокислотным профилем и значительное количество витаминов группы В.

Субстраты для культивирования микроорганизмов- природный газ.

Субстраты для культивирования микроорганизмов - спирты.

Одним из перспективных источников углерода для культивирования продуцентов белка высокого качества считается метиловый спирт. Его можно получать методом микробного синтеза на таких субстратах, как древесина, солома, городские отходы. Использование метанола в качестве субстрата затруднено из-за его химической структуры: молекула метанола содержит один атом углерода, тогда как синтез большинства органических соединений осуществляется через двухуглеродные молекулы. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichiapolymorpha, Pichiaanomala, Yarrowialipolytica. Наилучшими продуцентами на этом субстрате считаются бактерии, потому что они могут расти на метаноле с добавлением минеральных солей. Процессы получения белка на метаноле достаточно экономичны. По данным концерна Ай-Си-Ай (Великобритания), себестоимость продукта, производимого на метаноле, на 10-15% ниже, чем при аналогичном производстве, базирующемся на основе высокоочищенных n-парафинов. Высокобелковые продукты из метанола получают фирмы ряда развитых стран мира: Великобритании, Швеции, Германии, США, Италии. Продуцентами белка служат бактерии рода Methylomonas. Выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilusmethylotrophus, выгодно, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. При росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот - дегидрогеназой. Ведутся генно-инженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.

Субстраты для культивирования микроорганизмов - парафины

Для выращивания микроорганизмов с целью получения белка хорошо бы иметь богатый углеродом, но дешевый субстрат. Этому требованию вполне отвечают нормальные (неразветвленные) парафины нефти. Выход биомассы может достигать при их использовании до 100% от массы субстрата. Качество продукта зависит от степени чистоты парафинов. При использовании парафинов достаточной степени очистки, полученная дрожжевая масса может успешно применяться в качестве дополнительного источника белка в рационах животных. Первый в мире крупный завод кормовых дрожжей мощностью 70 000 т. в год.был пущен в 1973 г. в СССР. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы и несколько видов дрожжей, способных к быстрому росту на углеводородах: Candidamaltosa, Candidaguilliermondii, Candidalipolytica. В дальнейшем именно отходы от переработки нефти служили главным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 80-х гг. превысило 1 млн. т. в год, причем в СССР кормового белка получали вдвое больше, чем во всех остальных странах мира, вместе взятых. Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко сократились. Это произошло как в результате экономического кризиса 90-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них - необходимость очистки готового кормового продукта от остатков нефти, имеющих канцерогенные свойства.

В нашей стране мало районов, пригодных для выращивания сои, являющейся основным источником белковых добавок. Поэтому налажено крупнотоннажное производство кормовых дрожжей на n-парафинах. Действует несколько заводов мощностью от 70 до 240 тыс. тонн в год. Сырьем служат жидкие очищенные парафины.