Курсовая работа: Ферменты клинической диагностики

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.Г. БЕЛИНСКОГО

Естественно-географический факультет

Кафедра биохимии

Курсовая работа

ФЕРМЕНТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Выполнила: студентка группы БХ-41

Рахматуллина Равиля Ильясовна

Проверил: к.б.н., доцент

Соловьев Владимир Борисович

Пенза, 2009

Содержание

Введение

1.Энзимопатология

2.Энзимодиагностика

3.Основные ферменты, которые используются в клинической диагностике

3.1.Аспартатаминотрансфераза (ACT)

3.2. Аланинаминотрансфераза (АЛТ)

3.3. Амилаза

3.4.у-Глутамилтранспептидаза (ГГТ)

3.5. Креатинкиназа (КК)

3.6. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)

3.7. Щелочная фосфатаза(ЩФ)

4.Энзимотерапия

Заключение

Литература

Введение

Цель работы: ознакомление с основными ферментами, используемыми при клинической диагностики иоценка их информативности.

Предметом исследования являются основные ферменты клинической диагностики.

Достижения энзимологии находят все большее применение в медицине, в частности в профилактике, диагностике и лечении болезней. Успешно развивается новое направление энзимологии-медицинская энзимология, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования.

Медицинская энзимология развивается по трем главным направлениям, хотя возможности применения научных достижений энзимологии в медицине теоретически безграничны, в частности в области энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии.

Энзимодиагностика, безусловно, является важной и актуальной для современной медицины и науки, так как биохимические исследования, белкового спектра, активности ферментов в крови и других биологических жидкостей, которые осуществляются в этой области, способствуют выявлению причин, приводящих к различным поталогиям, и помогают предотвратить или ослабить их неблагоприятное действие на организм.

1. Энзимопатология

Область исследований энзимопатологии является теоретической, фундаментальной частью патологии. Она призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, основанные на данных нарушения механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента или группы ферментов. Обладая высокой каталитической активностью и выраженной органотропностью, ферменты могут быть использованы в качестве самых тонких и избирательных инструментов для направленного воздействия на патологический процесс. Как известно, из более чем 5000 наследственных болезней человека молекулярный механизм развития выяснен только у 2-3 десятков. Считают, что развитие болезни чаще всего связано с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного-единственного фермента в организме больного. Иногда болезни называют также энзимопатиями. Так, галактоземия-наследственное заболевание, при котором наблюдается ненормально высокая концентрация галактозы в крови. Болезнь развивается в результате наследственного дефекта синтеза фермента гексозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, катализирующего превращение галактозы в легкометаболизируемую глюкозу. Причиной другого наследственного заболевания - фенилкетонурии, сопровождающейся расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение фенилаланина в тирозин.

Энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматических болезней; ведутся работы по выяснению молекулярных основ атеросклероза, злокачественного роста, ревматоидных артритов и др. Нетрудно представить огромную роль ферментных систем или даже отдельных ферментов, нарушение регуляции активности и синтеза которых приводит к формированию или развитию патологического процесса.

2.Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Энзимодиагностика-развивается по двум путям.

Один путь-использование ферментов в качестве избирательных реагентов для открытия и количественного определения нормальных или аномальных химических веществ в сыворотке крови, моче, желудочном соке и др. (например, выявление при помощи ферментов глюкозы, белка или других веществ в моче, в норме не обнаруживаемых).

Другой путь-открытие и количественное определение самих ферментов в биологических жидкостях при патологии. Оказалось, что ряд ферментов появляется в сыворотке крови при распаде клеток (отсюда их название «некротические ферменты»). Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью. Известно около 20 тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изоферментов), главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии). Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500), открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.). Доказано, что органы и ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации ферментов между внутриклеточными и внеклеточными частями тела. Поэтому любые, даже незначительные, повреждения клеток (иногда функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперферментации (повышенное содержание ферментов в крови) до конца не расшифрован. Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в индивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

3.Основные ферменты, которые используются в клинической диагностике

3.1. Аспартатаминотрансфераза (ACT)

Аминотрансфера́зы (трансаминазы) — ферменты из группы трансфераз, переносящие группы атомов, содержащие азот. К этой группе ферментов относятся такие важные для клинической лабораторной диагностики ферменты, как АСТ и АЛТ.

Аспартатаминотрансфераза (ACT; глутамат-оксалоанетат-тран-саминаза; GOT L-аспартат: 2-оксоглутаратаминотрансфераза, КФ 2-6.1.1) катализирует реакцию переаминирования (трансаминирования) между аспартатом и α-кетоглутаратом:

α -Кетоглутарат + L-аспартат ↔ L-глутамат + оксалоацетат.

У млекопитающих наиболее высокая активность и концентрация ACT отмечена в печени, нервной ткани, скелетной мускулатуре и миокарде. Незначительная активность ACT определена и в крови здоровых людей. В большинстве тканей существует как минимум два изофермента ACT: митохондриальный изофермент (мАСТ), на всех поддерживающих средах движущийся к катоду, и растворимый в цитозоле изофермент ACT (цАСТ), мигрирующий к аноду. цАСТ состоит из двух идентичных субъединиц; это димер с молекулярной массой 93 кДа. мАСТ - тоже димер с молекулярной массой 91 кДа. Выделение изоферментов выявило существование нескольких изоформ со сходной кинетикой, но выраженными иммунологическими различиями. Изоферменты ACT имеют некоторое различие кинетических характеристик: оптимум действия мАСТ более низкий, чем цАСТ.

3.2. Аланинаминотрансфераза (АЛТ )

Аланинаминотрансфераза (АЛТ; глутамат-пируваттрансаминаза; GPT, L-аланин: 2-оксоглутаратаминотрансаминаза, КФ 2.6.1.2) катализирует реакцию переаминирования между L-аланином и α-кетоглутаратом:

L-аланин + α-кетоглутарат ↔ пируват + L-глутамат.

АЛТ - вторая активная аминотрансфераза, выделенная из тканей человека. АЛТ присутствует во многих органах: печени, почках, скелетных мышцах, миокарде, поджелудочной железе. Невысокая активность АЛТ отмечена и в сыворотке крови здоровых людей. Как и ACT, АЛТ присутствует в клетках в форме двух изоферментов - цитозольного и митохондриального, но последний нестабилен, содержание его в клетке низкое.

Клиническое значение определения концентрации аминотрансфераз.

Повышение активности аминотрансфераз отмечено при ряде патологических процессов, в которые вовлечена печень. Активность ACT и АЛТ повышена при остром панкреатите, холецистите, паразитарных заболеваниях, псориазе, ожогах, применении пропионлактона как противовирусного средства, перегрузке организма железом, гепатобилиарной патологии.

Увеличение активности аминотрансфераз можно отметить и у здоровых людей при диете, богатой белком или содержащей 25—30% сахарозы, а также у доноров.

Большое практическое значение имеет упоминание лекарственных

препаратов, обладающих невыраженным гепатотоксическим свойством. К ним на основании накопленного многими исследователями опыта относят аспирин, индометацин, линкомицин, анаболические стероиды, пероральные контрацептивы, тестостерон и другие андрогены, прогестерон, сульфаниламиды, пиридоксин, барбитураты, препараты меди и железа, антибиотики ( гентамицин, ампициллин, тетрациклин).

Активность ACT в крови возрастает при туберкулезе легких, септицемии, герпетической инфекции, вирусном гепатите, опухолях. Активность ACT снижается при малярии и беременности, не меняется при эмболии легочной артерии, пневмониях, абсцессах легкого, ревматоидном артрите. Увеличение активности АЛТ отмечено у пациентов при терапии некоторыми лекарственными средствами, особенно антибиотиками, гиполипидемическими препаратами, кетоацидозе, азотемии.

Исследование отношения мАСТ/общая активность ACT также было предложено в качестве диагностического теста. Отношение мАСТ/общая активность ACT снижено при общем гепатите и не изменено при обтурации желчных протоков, алкогольном поражении печени, метастазах в печень. Появление в сыворотке крови высокой активности мАСТ свидетельствует о некротических процессах в гепатоцитах. В остром периоде инфаркта миокарда повышение активности ACT — достоверный диагностический тест. В то же время активность ACT повышена в значительно меньшей степени, чем активность КК или ЛДГ. Клинико-морфологические исследования показали, что динамику активности ACT можно использовать для расчета объема поражения при инфаркте миокарда при небольших очагах некроза миоцитов столь же достоверно, как и на основании активности КК.

Предложено использовать повышение активности ACT в сыворотке крови как прогностический тест при остром лейкозе.

3.3.Амилаза

α-Амилаза [α -(1,4)-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1] -фермент, гидролизующий внутренние 1,4 α -гликозидные связи крахмала, гликогена и других полимеров глюкозы. В организме человека основные источники α -амилазы - поджелудочная и слюнные железы. Многочисленные изоформы, выделенные из биологических жидкостей и тканей человека, представляют собой, вероятно, гетерогенные продукты посттрансляционных изменений двух семейств изоферментов амилазы, синтез которых кодируют два локуса гена Ату-1, слюнной (С) тип амилазы и Ату-2, панкреатический (П) тип фермента, тесно связанные в хромосоме 1. Изоферменты С и П не имеют больших различий в аминокислотном составе. Гель-фильтрацией на сефадексе во фракции С-амилаз выделены две изоформы, одна из которых содержит углеводы. Молекулярная масса изоформ, содержащих углеводы, 57 кДа, не содержащих углеводы - 55 кДа. Изоэлектрические точки основных изоформ С-изоамилаз от 5,5 до 6,5. П-группа изоамилаз имеет меньшую молекулярную массу (53 кДа) и не содержит углеводов. Изоэлектрические точки этих белков варьируют от 5,7 до 7,0.

Убедительным доказательством того, что П-тип амилазы образуется только в поджелудочной железе, служит отсутствие этого изофермента у лиц с тотальной панкреатэктомией. С-изофермент α-амилазы, напротив, может быть синтезирован в разных органах и тканях. Высокая активность С-амилазы зафиксирована в ткани фаллопиевых труб и содержимом кисты яичников. Специфическая группа изоамилаз, продуцируемых тканями женских половых органов, не выявляется в сыворотке крови или моче здоровых людей; распределение изоамилаз идентично у мужчин и женщин. Изоамилазы, принадлежащие к С-группе, обнаружены и в женском молоке и раневой жидкости.

Клиническое значение определения активности амилазы в сыворотке крови.

Определение активности α-амилазы в сыворотке крови - наиболее распространенный тест диагностики острого панкреатита. При остром панкреатите активность фермента в сыворотке крови возрастает через 3-12 ч после болевого приступа, достигает максимума через 20—30 ч и возвращается к норме при благоприятном течении в пределах четырех дней. Активность α-амилазы (диастазы) в моче возрастает через 6-10 ч после подъема активности в сыворотке и возвращается к норме чаще всего через три дня после подъема.

В настоящее время широко известно, что увеличение обшей активности α-амилазы неспецифично для панкреатита и других заболеваний поджелудочной железы. Клинические исследования показали, что повышение активности α-амилазы происходит при ряде заболеваний, к которым относят кишечную непроходимость, заболевания желчных путей, аппендицит, паротит, внематочную беременность. Чувствительность и специфичность определения α-амилазы при диагностике острого панкреатита возрастают при изменении границ нормальных значений (дискриминационный уровень нормы и патологии — активность1,5—2 раза превышающая верхние границы нормы). В этом случае определение активности α-амилазы наиболее информативны первые сутки развития острого панкреатита. По мнению ряда авторов, определение активности α-амилазы в сыворотке крови при хроническом панкреатите не имеет диагностического значения.

У человека α-амилазу, свободно проходящую через фильтрационный барьер почечных телец, реабсорбируют клетки эпителия почечных канальцев так же, как и другие низкомолекулярные белки сыворотки крови. Увеличение активности амилазы в сыворотке крови может быть вызвано нарушением элиминации фермента. Пример — состояние, называемое макроамилаземией, когда фермент связан с иммуноглобулинами сыворотки крови и образует макромолекулярный комплекс. Такой комплекс не фильтруется в мочу и не может быть удален при помощи каких-то иных механизмов, что ведет к значительному и порой длительному увеличению активности α-амилазы в сыворотке крови. Макроамилаземия встречается у здоровых людей с частотой 1%, у лиц с гиперамилаземией - с частотой 2,5%. Макроамилаземия может быть диагностирована методом ультрацентрифугирования, ЭФ, гельхроматографии, предложен также простой тест преципитации комплекса полиэтиленгликолем.

Активность α -амилазы в сыворотке крови часто увеличена при почечной недостаточности, однако не совсем ясно, что является причиной такого увеличения - возрастание образования фермента или снижение его элиминации. В таких случаях дополнительную информацию может дать определение скорости экскреции α -амилазы или расчет клиренса фермента.

По данным многих авторов, наиболее чувствительным и специфичным тестом для диагностики панкреатита служит уровень активности П-изофермента α -амилазы. Особое значение этот тест приобретает, если у больного с предполагаемым диагнозом панкреатита обнаружена нормальная общая активность амилазы. По сниженной активности П-амилазы может быть диагностирован хронический панкреатит. Доля П-изоамилаз в обшей активности α -амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови, возможно, вследствие различий в экскреции изоферментов почками. Тем не менее диагностическое значение определения активности изоферментов α-амилазы в моче уступает таковому в крови.

3.4. у-Глутамилтранспептидаза

В последние годы в клинической химии подобающее место заняло определение активности у-глутамилтрансферазы (ГГТ; у-глутамил-транспептидазы, КФ 2.3.2.2).

ГГТ катализирует перенос у-глутамила на аминокислоту или пептид, на другую молекулу субстрата или воду. ГГТ - белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 90 кДа. Фермент содержит гидрофильный и гидрофобный фрагменты. Активный центр расположен на гидрофильном участке полипептидной цепи. Гидрофобная область — часть цепи, которой фермент прикреплен к мембране. Если экстракцию фермента из тканей провести с использованием в качестве детергента желчных кислот или тритона \ Х-100, ГГТ вместе с гидрофобным участком может быть переведена в раствор. Если в экстрагирующую смесь включены только протеазы (папаин или трипсин), гидрофобный фрагмент ГГТ остается на мембране, а в растворе оказывается гидрофильная часть полипептида ГГТ.

Гидрофильные фрагменты ГГТ, изолированные из печени или почек, иммунологически сходны, так же как и гидрофобные фрагменты ГГТ, изолированные из разных органов.

ГГТ занимает важное место в метаболизме аминокислот. Комплекс биохимических реакций реабсорбции аминокислот из первичной мочи, профильтрованной через фильтрационный барьер почечных телец, назван глутамиловым циклом. Этот процесс начинается с действия ГГТ, которая расположена на наружной поверхности клеточной мембраны и связывает аминокислоту первичной мочи с клеткой эпителия канальцев при участии естественного субстрата глутатиона, образуя тройной комплекс: аминокислота-ГГТ-глутатион. Отмечено ингибирование реакции высокими концентрациями субстратов. Как следствие связывания двух субстратов в активном центре фермента происходит перенос глутамиловой кислоты от глутатиона к аминокислоте. В этой фазе цикла аминокислоту переносят в клетку, где происходят последующие реакции, в которых глутамиловая цикло-трансфераза расщепляет связь между амино- и глутамиловой кислотой, потребляя молекулу АТФ. Присутствие ГГТ на мембране клеток других органов (тонкая кишка, хориоидальное сплетение и др.) дает основание предположить, что и в этих органах фермент принимает участие в транспорте аминокислот. Роль ГГТ печени полностью не выяснена; предположительно фермент связывает молекулы веществ, которые необходимо экскретировать.

Биологическая роль фермента связана также с регуляцией уровня глутатиона в тканях. Именно этим можно объяснить высокий уровень глутатиона в плазме крови и моче пациентов с генетически детерминированным отсутствием синтеза ГГТ. Регулируя уровень глутатиона, ГГТ может влиять на синтез белка, что объясняет повышенную удельную активность фермента в тканях с высокой скоростью метаболизма. Это же может быть причиной повышенного уровня фермента в тканях и крови новорожденных.

ГГТ содержится в основном в мембране клеток, обладающих высокой секреторной или адсорбционной способностью: эпителиальных клетках, выстилающих желчные пути, печеночных канальцах, проксимальных канальцах нефрона, панкреатической экзокринной ткани и выводных протоках, ворсинчатых клетках тонкой кишки. В порядке снижения удельной активности ГГТ ткани располагаются в следующей последовательности: почки, печень, поджелудочная железа, Щеточная кайма клеток тонкой кишки. Активность ГГТ не обнаружена в скелетных мышцах и миокарде.

Клиническое значение определения концентрации ГГТ в сыворотке крови

Наиболее частая причина повышения активности ГГТ в сыворотке крови — патология печени. Слабое токсическое воздействие на печень, вызывающее жировую инфильтрацию, прием алкоголя и лекарственных препаратов сопровождаются умеренным увеличением активности ГГТ. Более выраженное повышение активности фермента связано с внепеченочной и внутрипеченочной обструкцией, вторичным вовлечением печени в онкологические процессы организма путем метастазирования. Самая высокая активностьГГТ в сыворотке крови отмечена при закупорке желчного протока или злокачественных опухолях, прямо или опосредованно поражающих печень.

При отсутствии желтухи определение ГГТ — чувствительный тест для выявления патологии печени; клиническая чувствительность выше, чем у таких ферментов, как ЩФ и 5-нуклеотидаза. При онкологических заболеваниях нормальная активность ГГТ в сыворотке крови свидетельствует об отсутствии метастазов в печени, тогда как высокая активность ГГТ (в 12 раз и более выше нормы) служит индикатором поражения печени метастазами. При остром вирусном гепатите многократное исследование активности ГГТ позволяет следить за течением болезни: постоянно увеличенная активность ГГТ указывает на развитие хронической формы заболевания. При увеличении активности ЩФ и трудностях определения ее изоферментов полезно определять активность ГГТ для идентификации возможного источника гиперферментемии: активность ГГТостается в пределах нормы, если увеличение активности ЩФ вызвано костным изоферментом, и увеличена, когда фермент образуется в печени. В педиатрии определение активности ГГТ предпочтительнее, чем определение ЩФ, так как активность ГГТ не меняется с возрастом и полученные результаты легче интерпретировать.

Высокая активность ГГТ присутствует в крови людей, злоупотребляющих алкоголем. У 74% алкоголиков, страдающих гистологически подтвержденным поражением печени, увеличение активности ГГТбыло постоянным даже в периоды абстиненции. Существуют определенные различия между активностью ГГТв крови алкоголика и человека, принявшего значительную дозу алкоголя. У первых наступает увеличение активности ГГТдо 140% от нормальных значений с пиком активности через 18 ч, у вторых даже после тяжелого опьянения увеличение активности ГГТне превышает 15% в течение 12 ч.

Развитие инфаркта миокарда сопровождается изменениями активности ферментов сыворотки крови (КК, ЛДГ, ACT) и ГГТ,активность которой после приступа стенокардии остается повышенной в течение длительного времени. Повышение активности ГГТотмечено у 50% больных стенокардией и у части пациентов с другими заболеваниями (коронарная недостаточность, недостаточность кровообращения). При инфаркте миокарда остаются неясными механизмы увеличения активности ГГТ, поскольку она отсутствует в сердечной мышце.

Активность ГГТв моче выше, чем в сыворотке крови. Присутствующая в моче ГГТимеет почечное происхождение: фермент выделяется в мочу из разрушенных клеток проксимальных отделов канальцев, которые содержат ГГТ в высокой концентрации.

3.5.Креатинкиназа (КК)

Креатинкиназа-АТФ: креатин-1,4-фосфотрансфераза (КФ 2.7.3.2) — катализирует обратимый перенос фосфатного остатка между АТФ и креатином с образованием АДФ и креатинфосфата. Общепринято сокращенное название фермента — креатинкиназа (КК). КК — цитозольный и митохондриальный фермент, который функционирует в клетках многих тканей. Продукт реакции фосфокреатин - макроэргическое соединение, обеспечивающее энергией сокращение мышцы, ее расслабление и транспорт метаболитов в миоцит. В первое время активность КК в крови интересовала клинических химиков как тест для выявления поражения поперечнополосатой мускулатуры. В настоящее время активность КК — ведущий тест в диагностике инфаркта миокарда.

Наибольшее содержание КК отмечено в миокарде и скелетных мышцах, высокое содержание — в языке, мышце диафрагмы, низкое — в почках, легких, печени. КК — димер; в цитозоле клеток тканей человека присутствуют 2 субъединицы: М - мышечный тип и В — мозговой тип. Субъединицы представляют собой белки с молекулярной массой 41кДа с активным центром в каждой субъединице. Соответственно двум формам субъединиц димерная форма молекулы КК имеет следующие варианты: мышечный тип КК-ММ, гибридный димер КК-МВ, характерный для миокарда, и изофермент КК-ВВ, локализованный преимущественно в мозговой ткани.

Активность фермента и распределение его изоферментов органоспецифичны, поэтому идентификация и количественное определение изоферментов КК в сыворотке крови не только полезно для установления увеличения проницаемости мембран или повреждения специфического органа, но и дает возможность установления диагноза, наблюдения клинического течения и оценки прогноза заболевания. В электрическом поле наибольшей подвижностью обладает КК-ВВ, наименьшей - КК-ММ, гибридная форма КК-МВ занимает промежуточное положение. В соответствии с этим в классификации Международного союза теоретической и прикладной химии КК-ВВ обозначена изоферментом I КК, КК-МВ - II, КК-ММ - III. Для понимания источников появления в крови активности КК-МВ следует отметить, что у плода до 16-недельного возраста в мышечной ткани доминирует зародышевая форма КК, а именно КК-МВ, которая позже замещается КК-ММ. Определенная перестройка изоферментного состава КК происходит и при гипертрофии миокарда: повышается процентное содержание КК-МВ и КК-ВВ, а доля КК-ММ оказывается сниженной. Миоциты в условиях длительной гиперфункции повышают синтез изоформы КК-ВВ.

Клиническое значение определения активности КК и ее изоферментов.

Повышение активности КК в крови может быть следствием травмы, переохлаждения или перегревания, голодания и бактериальной интоксикации, дегидратации, поражения электрическим током. Повышенная активность КК-МВ отмечена при мышечной дистрофии разной этиологии, ишемическом рабдомиолизе с миоглобинурией, отравлении угарным газом. Активность КК-МВ повышалась, более чем на порядок превышая норму, у больных острым перикардитом.

Опыт применения изоферментной диагностики в блоке интенсивной терапии показал, что повышение в крови активности КК-МВ может происходить при выраженной недостаточности кровообращения, катетеризации сердца, отеке легких, аритмиях, кардиогенном шоке, алкогольной интоксикации, кровотечении из ЖКТ, травматической эпилепсии, травме грудной клетки. Активность КК-МВ повышена в крови пациентов при синдроме шока, развившемся при анемии, гиперкапнии, гипоксемии, молочнокислом ацидозе, выраженной гипотонии. Однако только в редких случаях в указанных ситуациях активность КК-МВ на 6% превышала активность КК. Учитывая возможности неспецифического повышения активности КК-МВ, надо помнить и о возможности пропустить небольшой инфаркт миокарда. У больных с гипертрофией миокарда активность КК-МВ в период инфаркта может достигать 1/3 активности КК.

Повышение активности КК в сыворотке крови может быть обусловлено увеличением активности изофермента КК-ММ. Активность КК-ММ в сыворотке крови повышается при прогрессирующей мышечной дистрофии, дерматомиозите, полимиозите, инфаркте миокарда, гипотиреозе, некоторых заболеваниях нервной системы. Активность КК-ММ увеличивается также после физической нагрузки, внутримышечных инъекций, хирургических операций. При мышечной дистрофии типа Дюшенна (наследственном, связанным с полом рецессивном заболевании) активность КК-ММ увеличивается в 8-90 раз по сравнению с нормой, активность изофермента увеличена также у носителей этого гена.

Активность КК-ВВ в крови отмечали во время аортокоронарного шунтирования. Полагают, что активность КК-ВВ может быть тестом аноксии тканей. Активность КК-ВВ в крови может также быть следствием гипоксического повреждения мозга, особенно в условиях перинатальной гипоксии. Активность КК-ВВ увеличена у 53% новорожденных с асфиксией. КК-ВВ присутствует в гладкой мускулатуре, но не определяется в сыворотке крови лиц с доброкачественными заболеваниями этих тканей. Одним из возможных объяснений повышения активности КК-ВВ в крови при сосудистых операциях служит предположение, что стенки вен, как, впрочем, и аорты, содержат только одну изоформу КК, а именно КК-ВВ. Активность изофермента КК-ВВ может быть повышена в крови при раке предстательной железы, мелкоклеточном раке легкого, аденокарциноме желудка, лейкозах, хронической почечной недостаточности, передозировке миорелаксантов. Метастазирование рака предстательной железы сопровождается особенно высокими цифрами активности КК-ВВ в крови. Исследователи сходятся во мнении, что активность КК-ВВ может быть использована как неспецифический маркер опухолевого процесса.

В ряде случаев при инфаркте миокарда, а иногда и в его отсутствие высокая активность КК сохраняется неопределенно долго. Наблюдаемые явления обусловлены циркуляцией в крови необычных форм КК и ее изоферментов. После разделения при ЭФ фракций КК на электрофореграмме становятся видимыми полосы, не соответствующие положению полос КК-ММ, КК-МВ и КК-ВВ, и можно отметить наличие изоформ КК, движущихся к катоду, что из белков сыворотки крови свойственно иммуноглобулинам. Известно, что окисление сульфгидрильных групп КК изменяет электрофоретическую подвижность молекул, однако при этом они по-прежнему движутся к аноду. У больных метастазирующим раком предстательной железы выделен изофермент КК, мигрирующий между КК-МВ и КК-ВВ.

3.6. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; L-лактат-НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27) - цинксодержаший фермент, катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную кислоту при участии НАД-Н₂ .

Фермент в кристаллической форме был получен из мышцы сердца. Подобным же образом были получены кристаллические ферментные препараты из скелетных мышц и печени. При рН 7,0 равновесие реакции смещено в сторону образования лактата, в щелочной среде реакция проходит в обратном направлении. ЛДГ может также реагировать с НАДФ в качестве кофермента, но значительно медленнее, чем с НАД.

ЛДГ - тетрамер; два локуса генов кодируют синтез двух олигомеров — М- и Н-субъединиц. М-субъединица синтезируется главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как Н-субъединица присутствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. Молекулярная масса каждой субъединицы составляет 35 кДа, каждого тетрамера - 140 кДа. Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25% длины полипептидной цепи. В тетрамерной структуре ЛДГ субъединицы связаны силами ионных и водородных взаимодействий. На каждой субъединице расположен каталитический центр; диссоциация тетрамера на димеры или мономеры приводит к потере ферментативной активности.

В цитоплазме клеток и сыворотке крови ЛДГ имеет 5 изоферментов, обозначаемых в соответствии с их подвижностью к аноду в электрическом поле: ЛДГ₁ (НННН), ЛДГ₂ (НННМ), ЛДГ₃ , (ННММ), ЛДГ₄ (НМММ) и ЛДГ₅ (ММММ). ЛДГ, участвует в окислении лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты). ЛДГ₅ оптимизирована природой для превращения пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень). Не все изоферменты ЛДГ гомогенны: при электрофоретическом разделении изоферментов ЛДГ сыворотки и эритроцитов в полиакриламидном геле обнаружено расщепление ЛДГ₃ на две полосы, которое позволяет предположить синтез двух форм ЛДГ₃ в тканях. Наличие молекулярных структур двух форм, подтвержденное в реакции с антисывороткой, объясняют различием пространственного (цис и транс) расположения Н-субъединиц и М-субъединиц в тетрамере.

В тканях человека активность ЛДГ на 1 г сухой массы уменьшается в последовательности: почки - скелетная мышца – поджелудочная железа — селезенка — печень — плацента. Изоферменты ЛДГ, и ЛДГ₂ преобладают в эритроцитах, лейкоцитах, миокарде, почках, ЛДГ₄ и ЛДГ₅ — в печени, скелетных мышцах, неопластических тканях, наиболее высокое содержание ЛДГ₃ отмечают в лимфоидной ткани, тромбоцитах и опухолях.

Свойства изоферментов ЛДГ определены особенностями входящих в них субъединиц. Изоферментам ЛДГ присущи разные кинетические характеристики: рН, при котором они проявляют максимальную активность, сродство к субстратам и кофакторам.

Клиническое значение определения активности ЛДГ

Активность ЛДГ в сыворотке крови повышается при многих патологических состояниях, поэтому для дифференциальной диагностики заболеваний более целесообразно исследовать изменения спектра изоферментов ЛДГ. В настоящее время накоплено большое количество данных о распределении изоферментов ЛДГ в тканях и об изменении спектра изоферментов ЛДГ в сыворотке крови при различных заболеваниях. Изоферментный спектр скелетной мускулатуры показывает преобладание ЛДГ₅ . При мышечной дистрофии отмечены увеличение более подвижных изоферментов ЛДГ и снижение активности ЛДГ₅ , что характерно и для многих нейромышечных заболеваний. Причиной изменения спектра изоферментов может быть быстрое удаление малоподвижных изоферментов из циркуляции. Активность ЛДГ₅ в сыворотке крови — чувствительный индикатор гепатоцеллюлярного поражения, увеличение его активности обычно наблюдают при гепатите, гипоксии печени (включая застой крови в печени вследствие сердечной недостаточности), лекарственной интоксикации, циррозе, опухолях и травме. Активность ЛДГ в сыворотке крови не повышается при хронических заболеваниях почек и уремии, но иногда возрастает после гемодиализа или плазмафереза, что может быть объяснено удалением из крови ингибиторов (мочевина, оксалаты).

Общая активность ЛДГ при инфаркте миокарда наиболее значительно повышается в течение первых 2 сут после приступа стенокардии и до исходного уровня понижается медленно, в течение 14-16 дней, эпизодическое повышение ЛДГ можно отметить и в более поздние сроки.

Активность ЛДГ подвержена гормональному влиянию. Большие дозы тироксина снижали синтез фермента, при этом в большей мере отмечено ингибирование синтеза субъединицы М. Норадреналин и адреналин вызывают увеличение общей активности ЛДГ с преобладанием активности ЛДГ₁ , и ЛДГ₂ . Активность фермента в крови возрастает при действии анаболических стероидов и этанола, а также ряда медикаментозных препаратов — клофибрата, кофеина, сульфаниламидов и др.

Спектр изоферментов ЛДГ может меняться при неопластических процессах. В таких случаях его трудно интерпретировать, так как источником изоферментов ЛДГ служит не только неопластическая ткань, но и ткани, разрушаемые метастазами. Однако изоферментный спектр транссудатов при опухолевом поражении сходен с таковым сыворотки крови, тогда как в воспалительных экссудатах преобладает активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂ . Для ЛДГ, как и для других ферментов, при опухолевом процессе характерен синтез изоферментов, свойственных эмбриональным тканям. Недифференцированные эмбриональные ткани имеют спектр изоферментов ЛДГ, в котором преобладают ЛДГ₂ и ЛДГ₃ , а также ЛДГ₄ . В злокачественных опухолях обнаружено три вида распределения изоферментов ЛДГ. Увеличение содержания ЛДГ₄ и ЛДГ₅ выявлено при опухолях предстательной железы, матки, молочных желез, желудка, толстой кишки, мочевого пузыря и некоторых типах опухолей мозга. У больных лейкозом, злокачественной лимфомой, нейробластомой, феохромоцитомой, а также при опухолях полости рта, раке бронхов и некоторых типах опухолей мозга увеличена активность ЛДГ₂ , ЛДГ₃ , ЛДГ₄ . Увеличение активности ЛДГ, отмечено в сыворотке крови больных с некоторыми типами опухолей мозга и разными типами опухолей половых органов.

Возможность повышения активности ЛДГ, при опухолевом процессе следует учитывать при диагностике инфаркта миокарда. Иногда при опухолях мозга, раке пишевода, нейробластоме отмечают необычную дополнительную полосу при ЭФ сыворотки крови и ткани опухоли. Определение спектра изоферментов ЛДГ в сыворотке крови при онкологических заболеваниях полезно не только для диагностики, но и для контроля эффективности лечения. Обнаружено, что нормализация спектра изоферментов ЛДГ коррелирует с успешностью ответа больного на лечение.

Наличие осложнений при инфаркте миокарда и сопутствующие заболевания могут изменить спектр ЛДГ и активность ЛДГ. Выявление спектра изоферментов, характерного для инфаркта миокарда, возможно при застое крови в печени и почках вследствие сердечной недостаточности, при ишемическом поражении некоторых органов из-за резкого снижения сердечного выброса. При эмболии легочной артерии, которую в ряде случаев приходится дифференцировать с инфарктом миокарда, увеличение в крови активности ЛДГ₂ и ЛДГ₃ может быть объяснено выходом ферментов из тромбоцитов, патологией печени, вызванной венозной гипертензией, анемией коркового слоя надпочечников и почек. Поскольку эти нарушения не всегда удается различить, изменение спектра изоферментов ЛДГ интерпретировать непросто.

В сыворотке крови тяжелобольных (как правило, в терминальном состоянии) методом ЭФ на ацетате целлюлозы выявляется дополнительная полоса, более близкая к катоду, чем ЛДГ₅ , названная ЛДГ₆ . Во всех наблюдениях в тканях печени, скелетных мышцах, почке, селезенке и надпочечниках также отмечено присутствие ЛДГ₆ ; в ряде случаев появление этой фракции носило транзиторный характер, ЛДГ₆ не обнаружена в тканях миокарда. Считают, что нет нозологической формы заболевания, для которой характерна ЛДГ₆ , но есть тяжелые клинические состояния, обусловливающие ее появление, к которым следует отнести выраженный ацидоз, гипотонию и сепсис.

3.7.Щелочная фосфатаза (ЩФ)

Щелочная фосфатаза (ЩФ) - фосфогидролаза моноэфиров орто-фосфорной кислоты (КФ 3.1.3.1) - гидролизует разные синтетические субстраты при оптимуме рН, равном 10,0; субстрат фермента in vivo точно не известен. ЩФ - гликопротеин; по структуре это димер с кажущейся значительной вариацией молекулярной массы фермента в разных тканях. ЩФ - металло-фермент, в состав активного центра фермента входит атом цинка. Полагают, что атом цинка повышает активность фермента, обеспечивая конформационные изменения и гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты. Каждый мономер ЩФ содержит три металлосвязывающих центра. Лишенный ионов цинка фермент теряет активность, но восстанавливает ее после добавления металла. Активность фермента возрастает в присутствии ионов магния, для оптимальной активности необходимо определенное соотношение ионов магния и цинка.

ЩФ присутствует во всех органах человека; наиболее высокая удельная активность фермента обнаружена в эпителии тонкой кишки, эпителии канальцев почек, остеобластах, гепатоцитах и плаценте- фермент плотно связан с клеточной мембраной гидрофобным карбоксильным концом полипептидной цепи; гидрофобный конец цепи идентичен у всех изоферментов ЩФ. ЩФ прикреплена к плазматической мембране с помощью фосфатидилинозитолгликанового якоря. Молекулы ЩФ на поверхности плазматической мембраны располагаются неравномерно.

Молекулярная масса ЩФ составляет 130-220 кДа. Ассоциация ЩФ с гликозаминогликанами (нейраминовой кислотой) может изменить не только молекулярную массу фермента, но и заряд молекулы и ее подвижность в электрическом поле. Степень гликозилирования ЩФ в тканях может влиять на ее термолабильность.

В организме человека биосинтез фермента кодируют три гена: один — печеночный, костный и почечный изоферменты, другой — кишечный изофермент и третий — плацентарную ЩФ. Полагают, что существует и 4-й ген, кодирующий синтез зародышевой ЩФ. Последняя локализована в тонкой кишке плода примерно до 30 недель беременности. Эмбриональные и зрелые формы ЩФ сходны по каталитической активности. Выделение ЩФ из ткани печени с помощью фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы приводит к образованию форм, сходных с присутствующими в сыворотке крови. Эти данные позволяют считать, что формы ЩФ сыворотки крови образуются путем ферментативного гидролиза тканевых форм.

Клиническое значение определения активности ЩФ.

Повышение активности ЩФ в сыворотке крови не всегда позволяет с достаточной степенью достоверности составить представление об органотопической патологии.

В клинической биохимии активность ЩФ наиболее часто используют в диагностике патологии гепатобилиарной системы и костной ткани. Активность ЩФ сыворотки крови часто повышена при обструктивных заболеваниях печени, холестазе, гепатите, явлениях гепатотоксичности, болезни Педжета, остеомаляции, новообразованиях, вовлекших в патологический процесс печень и костную ткань.

Низкая или даже неопределяемая активность ЩФ отмечена при гепатолентикулярной дегенерации. Механизм этого феномена неясен, предполагают, что ион меди конкурирует с цинком за место в активном центре ЩФ, что ведет к резкому падению активности фермента. Применение гиполипидемических препаратов, в частности клофибрата, также ингибирует фермент.

У недоношенных детей с целью ранней диагностики рахита рекомендовано определять активность ЩФ.

Исследование активности ЩФ у больных с синдромом гипофосфатазии указывает на важную роль ЩФ в процессах минерализации костной ткани. Синдром гипофосфатазии - врожденное заболевание костной ткани, характеризующееся избирательной недостаточностью синтеза ЩФ. У пациентов с подобной патологией в тканях и сыворотке крови значительно снижена активность печеночного, костного и почечного изоферментов ЩФ при нормальной активности плацентарного и кишечного изоферментов. Другая особенность заболевания - накопление в крови и моче фосфорсодержащих комплексов, служащих эндогенным субстратом ЩФ. К ним относят фосфоэтаноламин, пирофосфат, П-5-Ф и т. д. Заболевание вызвано точечными мутациями гена, кодирующего синтез фермента.

Повышение активности ЩФ происходит не только в условиях активного роста костной ткани, но и при ее разрушении - остеопорозе и последующей остеомаляции. При тяжелом остеопорозе и остеомаляции активность ЩФ в сыворотке крови может быть нормальной или слабо повышенной (в 2—3 раза). Остеомаляция, верифицированная гистологически, может протекать при нормальной активности ЩФ.

Активность ЩФ в сыворотке крови может быть повышена при остеомиодистрофии, развивающейся как осложнение длительного гемодиализа. При введении циклоспорина после трансплантации повышенная активность ЩФ в большей мере зависит от токсического влияния препарата на гепатоциты и в меньшей мере связана с патологией остеобластов. У пациентов с гиперпаратиреозом активность ЩФ сыворотки крови обычно в пределах нормы, но при развитии остеопороза, особенно остеонекроза, может быть значительно увеличена.

Исследование активности ЩФ оказывается полезным и в дифференциальной диагностике внутри- и внепеченочного холестаза. В случае экстрагепатобилиарной обструкции при камнях желчного протока и желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается в 10 раз и более. Внутрипеченочная обструкция желчных путей при гепатите также сопровождается повышением активности ЩФ, но степень гиперферментемии не превышает 2—3-кратного значения. Острые некротические изменения гепатоцитов могут не сопровождаться повышением активности ЩФ до тех пор, пока в патологический процесс не будут вовлечены желчные канальцы и не произойдет задержка желчеотделения. В то же время далеко не во всех случаях поражения паренхимы печени существует четкая корреляционная зависимость между активностью ЩФ сыворотки крови и содержанием в ней билирубина. В начале развития внутрипеченочного холестаза увеличение активности ЩФ может быть следствием повышения синтеза белка в гепатоцитах; последующее повышение активности ЩФ в сыворотке крови, особенно в форме макро-ЩФ, связано с нарушением целостности клеток желчных канальцев.

4. Энзимотерапия

Энзимотерапия , т.е. использование ферментов и модуляторов (активаторов и ингибиторов) действия ферментов в качестве лекарственных средств. До сих пор работы в этом направлении почти не выходят за рамки эксперимента. Исключение составляют некоторые протеиназы: пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин, химопсин), которые применяют для лечения ряда болезней пищеварительного тракта. Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНКаза, ДНКаза, гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси с протеиназами используются при ожогах, для обработки ран, воспалительных очагов, устранения отеков, гематом, келоидных рубцов, кавернозных процессов при туберкулезе легких и др. Ферменты применяются также для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, растворения сгустков крови. В нашей стране разработан первый в мире препарат иммобилизованной стрептокиназы, рекомендованный для лечения инфаркта миокарда. Калликреины-ферменты кининовой системы используются для снижения кровяного давления.

Важной и многообещающей областью энзимотерапии является применение ингибиторов ферментов. Так, естественные ингибиторы протеиназ (α₁ -трипсин, α₂ -химотрипсин, α-макроглобулин) нашли применение в терапии острых панкреатитов, артритов, аллергических заболеваний, при которых отмечается активация протеолиза и фибринолиза, сопровождающаяся образованием вазоактивных кининов.

В последнее время получило признание применение в онкологической клинике ферментов бактериальной природы в качестве лекарственных средств.

Заключение

Специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика. Некоторые ферменты, проферменты и их субстраты в норме циркулируют в крови. В крови присутствуют также нефункциональные ферменты, концентрация которых в плазме на несколько порядков ниже, чем в тканях и органах. Появление этих ферментов в плазме в повышенных концентрациях, как правило, связано с патологией. Обычно заболевание того или иного органа, сопровождающееся разрушением его клеток, приводит к выходу из них ферментов в плазму крови, в которой и тестируется увеличение ферментативной активности. Так, повышение активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы в сыворотке крови наблюдается при инфекционном гепатите, раке печени и инфаркте миокарда. Симптомом мышечной дистрофии является повышение в плазме крови активности креатинкиназы-важнейшего фермента, обеспечивающего образование необходимого для поддержания мышечной деятельности.

Известно,что активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) возрастает в сыворотке крови при болезнях сердца, а аланинаминотрансферазы (АЛТ)-при болезнях печени. Нередко в энзимодиагностике используют анализ соотношения активности нескольких ферментов. Так, при остром гепатите наблюдается повышенное соотношение активности амилаза/липаза; при злоупотреблении алкоголем и связанным с этим риском возникновения заболеваний сердца и печени наблюдается соотношение активности АСТ/АЛТ, превышающее 2.

Широко используется в энзимодиагностике анализ множественных форм (изозимов) ферментов. Например, при инфаркте миокарда в крови резко возрастает активность быстромигрируюших при электрофорезе (анодных) форм лактатдегидрогеназы, а при инфекционном гепатите, напротив, возрастает активность катодных изозимов этого фермента.

Кроме лактатдегидрогеназы, на практике используется анализ изоферментов кислой фосфатазы (при раке предстательной железы), щелочной фосфатазы (болезни костей, рахит и др.), креатинкиназы (болезни сердца). В тестировании раковых заболеваний используются изоферменты гексокиназы (по их соотношению удается даже определить стадию развития ракового поражения при гепатомах Морриса), пируваткиназы (опухоли печени, мозга и рабдосаркома), альдолазы (опухоли мозга и печени), фосфофруктокиназы (гепатомы), енолазы (рак мозга), лактатдегидрогеназы (опухоли желудка, щитовидной железы, почек, яичников, матки, молочной железы).

Для интерпретации полученных результатов исследования важно знать нормальные величины активности изучаемого фермента. Кроме того, иногда необходимо учитывать возраст, пол, характер питания, интенсивность физической нагрузки. Сывороточные ферменты могут значительно менять свою активность под влиянием лекарственных препаратов, ряда веществ (например, алкоголя).

Таким образом, области применения ферментов в медицине действительно безграничны. Рассмотренные примеры ясно показывают, какие замечательные и многообещающие перспективы уже сегодня открывает перед будущими врачами медицинская энзимология.

Список литературы

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник.-3-е изд., перераб. и до.- М.:Медицина,2004.-704с.:ил.-(Учеб. лит. Для студентов мед. вузов).

2.Биохимия:Учебник/ Под ред. Е.С. Северина.- 4-е изд., испр.- М.:ГЭОТАР - Медиа,2006.-784с.: ил.

3.Биохимические основы жизнидеятельности человека: учеб. пособие для студентов/ [Ю.Б. Филиппович, А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова, Н.М. Кутузова].- М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС,2005.- 407с.:ил.

4.И.М.Рослый, С.В.Абрамов, В.И. Покровский. Ферментемия- адаптивный механизм или маркер цитолиза?/Вестник Российской Академии Медицинских наук.М.:Медицина,2002г.№8.с3-8.

5.Клиническая биохимия: учебное пособие/ под ред. В.А.Ткачука- 3-е изд., исп. и доп.- М.: ГЭОТАР-Медиа,2008.-264с.: илл.

6.Клиническая ферментология. Под ред. проф. д-ра Э. Щеклика. Польское государственное медицинское издательство. Варшава 1966г.492с.

7. Нейрохимия. Учебник для биологических и медицинских вузов под ред. акад. РАМН И.П. Ашмарина и проф. П.В. Стукалова. Москва: Издательство Института биомедицинской химии РАМН. 1996 г. с. 401-406.

8.Цыганенко А.Я., В.И.

Жуков, В.В. Мясоедов, И.В. Завгородний. Клиническая биохимия (Учебное пособие для студентов медицинских вузов)- М.:ТриадаХ-2002, 504с.