| Скачать .docx |
Курсовая работа: Биотехнология
1. Основные этапы развития биотехнологии. Характеристика эры антибиотиков.
Биотехнология – это область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуществляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах[1] .
Действительно, она включает на первый взгляд, совершенно не связанные между собой разделы научных знаний: микробиологию, анатомию растений и животных, биохимию, иммунологию, клеточную биологию, физиологию растений и животных, различные систематики, экологию, генетику, биофизику, математику и много других областей естествознания.
Постоянно увеличивающееся разнообразие современной биологии началось после окончания второй мировой войны, когда в биологию внедрились другие естественнонаучные дисциплины, такие как физика, химия и математика, которые сделали возможным описание жизненных процессов на новом качественном уровне - на уровне клетки и молекулярных взаимодействий.
Именно существенные успехи в фундаментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной генетики и молекулярной биологии, достигнутые во второй половине текущего столетия, создали реальные предпосылки управления различными (пусть, возможно, и не самыми главными) механизмами жизнедеятельности клетки. Сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического приложения результатов фундаментальных наук. Можно с уверенностью утверждать, что биотехнология является наиболее разительным примером того, как результаты, казалось бы "чистой науки", находят применение в практической деятельности человека. Основой, обеспечивающей благоприятную ситуацию для бурного развития биотехнологии, явились революционные открытия и разработки:
Доказательства роли нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации в биологических системах (имеются в виду индивидуальные клетки и отдельные организмы, а не их популяции);
Расшифровка универсального для всех живых организмов генетического кода;
Раскрытие механизмов регуляции функционирования генов в процессе жизни одного поколения организмов;
Совершенствование существовавших и разработка новых технологий культивирования микроорганизмов, клеток растений и животных; как логическое следствие из вышесказанного, явилось создание (возникновение) и бурное развитие методов генетической и клеточной инженерии, с помощью которых искусственно создаются новые высокопродуктивные формы организмов, пригодные для использования в промышленных масштабах.
Расшифровка генома человека.
Абсолютно новым направлением является так называемая инженерная энзимология, возникшая вследствие развития современных методов изучения структуры и синтеза белков-ферментов и выяснения механизмов функционирования и регуляции активности этих соединений (важных элементов клетки). Достижения в этой области позволяют направленно модифицировать белки различной сложности и специфичности функционирования, разрабатывать создание мощных катализаторов промышленно ценных реакций с помощью высоко стабилизированных иммобилизованных ферментов.
Все эти достижения вывели биотехнологию на новый уровень ее развития, позволяющий сознательно и целенаправленно управлять сложными клеточными процессами. Данная новая область биологических знаний и ее последние достижения уже стали крайне важными для здоровья и благополучия человека.
И все же, что ожидает биотехнологию в случае реализации всех надежд, которые на нее возлагаются? И, наконец, что же такое биотехнология и каковы ее направления деятельности?
Термин "биотехнология" был введен в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки при описании процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология – это "все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты".
Биотехнология на самом деле не что иное, как название, данное набору технических приемов (подходов) и процессов, основанных на использовании для этих целей биологических объектов.
Термин биотехнология включает составляющие "биос ", "техне ", "логос " греческого происхождения (от греч. "биос " – жизнь, "техне " – искусство, мастерство, умение и "логос " – понятие, учение)[2] .
Биотехнологические направления имеют своей целью создание и практическое внедрение (т. е. практическое использование) активных веществ и лекарственных препаратов, кормовых добавок, средств защиты и т.д. Однако следует отдавать себе отчет в том, что биотехнология не является чем-то новым, ранее не известным, а представляет собой развитие и расширение набора технологических приемов, корни которых появились тысячи лет тому назад. Биотехнология включает многие традиционные процессы, давно известные и давно используемые человеком. Это пивоварение, хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, приготовление многих восточных пряных соусов, а также разнообразные способы утилизации отходов. Во всех перечисленных процессах использовались биологические объекты (пусть даже без достаточных знаний о них), и все эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда, эмпирически. Начало этого этапа биотехнологии теряется в глубине веков, и он продолжался примерно до конца XIX в.
Работы великого французского ученого Луи Пастера (1822-1895) заложили фундамент практического использования достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях (пивоварение, виноделие, производство уксуса) и ознаменовали начало нового, научного периода развития биотехнологии. Для этого периода характерно развитие промышленной биотехнологии, в особенности ферментационных процессов в промышленных масштабах. Были разработаны стерильные процессы производства путем ферментации ацетона, глицерина. Интенсивно изучаются основные группы микроорганизмов – возбудителей процессов брожения, исследуются биохимические особенности данных процессов.
Вторая половина XX-го века является эрой антибиотиков, которые занимают ведущее место в современной химиотерапии бактериальных инфекций и онкологических заболеваний. Использование антибиотиков в медицине способствовало успеху борьбы с тяжелыми инфекциями и в целом прогрессу медицины, демографическим "взрывам" и увеличению продолжительности жизни.
Создание антибактериальных препаратов является одним из наиболее важных достижений ХХ века. Пенициллин, синтезированный более 60 лет назад, открыл новую эру в борьбе с инфекционными болезнями. Сегодня известно около 20 групп антибиотиков, которые продаются под 1000 торговых наименований. Без них невозможно представить себе современную медицину, благодаря им спасены миллионы человеческих жизней. Эволюция создания антибактериальных препаратов во многом отражает уровень развития общества, возможности научно технического прогресса.
Что такое антибиотики? Это вещества, избирательно подавляющие жизнедеятельность микробов. Антибактериальные средства подразделяют на природные, являющиеся продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, и получаемые искусственным путем в результате химического синтеза, – так называемые полусинтетические. Как следует из определения, антибиотики активны только в отношении микроорганизмов и грибов. Они не действуют на вирусы. Антибиотик и микроорганизм – это две противоборствующие силы. Изобретатели антибиотиков каждый раз придумывают все более изощренные методы уничтожения микробов, а микробы, эволюционируя, создают порой уникальные, абсолютно непостижимые механизмы защиты. Пенициллины, цефалоспорины поражают микробы, нарушая синтез клеточной стенки микроорганизмов. Макролиды, тетрациклины, линкозамиды ингибируют синтез белка в рибосомах микроорганизмов. Хинолоны, фторхинолоны дезорганизуют репликацию ДНК микробной клетки, а нитрофураны - синтез ДНК. Микроорганизмы, защищаясь, способны вырабатывать ферменты, разрушающие антибиотик. Они укрепляют, по сути, «замуровывают» клеточную стенку, и антибиотик не может проникнуть внутрь. Есть микроорганизмы, которые создали нечто подобное насосу и «выкачивают» проникший в них антибиотик. А «полем боя» является человеческий организм, который реагирует и на микроб, и на антибиотик, и на их противостояние[3] .
Реакция организма зависит как от его индивидуальных особенностей (иммунитета, способности метаболизировать продукты обмена, устойчивости центральной и вегетативной нервной систем), так и от характеристики микроба, его инвазивности – умения преодолевать защитные барьеры и диссеминироваться в организме, патогенности – способности вызывать болезнь. Таким образом, лечение инфекционного заболевания антибиотиками – сложная задача, и, решая ее, нужно с большой ответственностью подходить к выбору антибактериальных препаратов.
В настоящее время, приступая к созданию антибиотика, ученые ставят перед собой задачу: создать продукт, влияние которого будет распространяться на максимально большой пласт различных патогенов. Однако в почете те антибактериальные средства, которые, действуя на многие патогены, в отношении некоторых из них все же более агрессивны. Например, разработаны препараты, избирательно действующие на резистентные, устойчивые микроорганизмы, но при этом они уничтожают и другие патогены.
Процесс культивации микроорганизмов – ферментация – начинается с того момента, когда заранее подготовленный посевной материал вводится в реактор. Размножение культуры микроорганизма характеризуется четырьмя временными фазами[4] : лаг-фаза; экспоненциальная; стационарная; вымирание.
Во время лаг-фазы метаболизм клеток направлен на то, чтобы синтезировать ферменты для размножения в конкретной среде. Длительность лаг-фазы может быть разной для одной и той же культуры и среды, так как на неё влияет множество факторов. Например, сколько в посевном материале было нерастущих клеток.
Экспоненциальная фаза – это период роста, когда происходит деление клеток с экспоненциальным ростом численности популяции. Этот период ограничен во времени количеством питательной среды. Питательные вещества кончаются или рост клеток замедляется из-за выделения токсичного метаболита.
Рост прекращается и наступает так называемая стационарная фаза. Метаболизм продолжается и может начаться выделение вторичных метаболитов. Во многих случаях целью является получение не биомассы, а именно вторичных метаболитов, так как они могут использоваться для получения ценных продуктов и препаратов. В этих случаях ферментация целенаправленно удерживается в стационарной фазе.
Если продолжать фермениацию дальше, клетки постепенно будут терять активность, т.е. вымирать.
По характеру подкормки процессы культивирования бывают трёх видов:
периодический;
подкормочный;
непрерывный.
В периодическом процессе реактор заполняется свежей питательной средой, потом в него вводится посевной материал. По окончании ферментации содержимое выводится на стадию выделения, реактор моется и стерилизуется, и всё начинается снова.
В подкормочном процессе непрерывно или порциями в реактор вводится свежая питательная среда. Скорость ввода обычно определяется скоростью роста или биосинтеза. Когда реактор наполняется, его частично или полностью опорожняют. Процесс завершается или продолжается.
В непрерывном процессе культивационная жидкость выводится из реактора непрерывно. Такой процесс может протекать очень долго, и его длительность обычно определяется производственной необходимостью и техническими факторами.
Наиболее распространена ферментация с подкармливанием, её чаще всего применяют для биопродуктов. В этом случае устраняются недостатки периодического процесса путём небольших технических изменений.
Непрерывные процессы чаще всего применяются при производстве биохимикатов в больших количествах. Эти процессы самые экономичные, но для их реализации нужны значительные технические преобразования и более глубокое понимание кинетики данной ферментации.
Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов). Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).
Глубинная ферментация проводится в аппаратах емкостью 50 м3 с заполнением на 70–75 %. В качестве посевного материала используют мицелий, подрощенный также в условиях глубинной культуры. В производственном аппарате, куда подрощенный мицелий передается по стерильной посевной линии, питательная среда содержит 12–15 % сахаров. Ферментацию проводят при 31–32° при непрерывном перемешивании. В ходе процесса кислотообразования (5–7 суток) реализуют интенсивный режим аэрации (до 800–1000 м3/ч) с дробным добавлением сахаров, 2–3 подкормки. Выход лимонной кислоты составляет от 5 до 12 %, остаточная концентрация сахаров – 0.2–1.5 %, доля цитрата – 80–98 % от суммы всех органических кислот.
Получить производные антибиотиков можно с помощью как химического, так и биологического синтеза. Известен и комбинированный способ получения препаратов. В этом случае ядро молекулы антибиотика формируется при биосинтезе с помощью соответствующих микроорганизмов-продуцентов, а «достройка» молекулы осуществляется методом химического синтеза. Полученные этим способом антибиотики называются полусинтетическими. Так были получены и нашли широкое применение в клинике весьма эффективные полусинтетические пенициллины (метициллин, оксациллин, ампициллин, карбенициллин) и цефалоспорины (цефалотин, цефалоридин) с новыми по сравнению с природными антибиотиками ценными терапевтическими свойствами.
Все эти данные, накопленные в процессе становления и развития науки об антибиотиках, потребовали уточнения термина «антибиотики». В настоящее время антибиотиками следует называть химические соединения, образуемые различными микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, а также производные этих соединений, обладающие способностью в незначительных концентрациях избирательно подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель. Вполне вероятно, что и эта формулировка с дальнейшим прогрессом антибиотической науки будет уточняться.
В первые годы после открытия антибиотиков их получали с использованием метода поверхностной ферментации. Этот метод заключался в том, что продуцент выращивали на поверхности питательной среды в плоских бутылях (матрацах). Чтобы получить сколько-нибудь заметные количества антибиотика, требовались тысячи матрацев, каждый из которых после слива культуралыюй жидкости необходимо было мыть, стерилизовать, заполнять свежей средой, засевать продуцентом и инкубировать в термостатах. Малопроизводительный способ поверхностной ферментации (поверхностного биосинтеза) не мог удовлетворить потребностей в антибиотиках. В связи с этим был разработан новый высокопроизводительный метод глубинного культивирования (глубинной ферментации) микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Это позволило в короткий срок создать и развить новую отрасль промышленности, выпускающую антибиотики в больших количествах.
Метод глубинного культивирования отличается от предыдущего тем, что микроорганизмы-продуценты выращивают не на поверхности питательной среды, а во всей ее толще. Выращивание продуцентов ведут в специальных чанах (ферментаторах), емкость которых может превышать 50 м3. Ферментаторы снабжены приспособлениями для продувания воздуха через питательную среду и мешалками. Развитие микроорганизмов-продуцентов в ферментаторах происходит при непрерывном перемешивании питательной среды и подаче кислорода (воздуха).
При глубинном выращивании во много раз по сравнению с выращиванием продуцента на поверхности среды увеличивается накопление биомассы (из расчета на единицу объема питательной среды), а значит, и возрастает содержание антибиотика в каждом миллилитре культуральной жидкости, т. е. повышается ее антибиотическая активность.
3.Генетическая инженерия. Ферментный синтез генов на основе изолированной матричной РНК.
Генетическая инженерия – направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в т.ч. не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств[5] .
В основе генетической инженерии лежат достижения молекулярной биологии и прежде всего установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Возможность получения и направленного использования фрагментов нуклеиновых кислот, выделения отдельных участков полинуклеотидной цепи с точностью до одного нуклеотида и осуществления in vitro синтеза нуклеиновых кислот с новыми сочетаниями нуклеотидных звеньев, появилась у генетической инженерии благодаря успехам энзимологии.
Изменение наследственных свойств организма с помощью генетической инженерии состоит в конструировании из различных фрагментов ДНК нового генетического материала, введении этого материала в организм реципиента, создании условий для функционирования введенного генетического материала и его стабильного наследования. Гены или фрагменты ДНК могут быть получены путем химического синтеза. Однако этот процесс трудоемок и требует знания последовательности нуклеотидов, составляющих ген. Более эффективен метод синтеза структурного гена на информационной РНК (иРНК) как на матрице с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Однако структурные гены в организме составляют функциональный комплекс с регуляторными элементами, нуклеотидные последовательности которых не воспроизводятся в молекуле иРНК. Поэтому указанный способ не позволяет осуществить синтез структурной и регуляторной области гена в совокупности, т.е. функционирующего гена в целом.
Методы получения целого функционирующего гена были впервые разработаны на бактериальных клетках. Их основой является способность некоторых плазмид – небольших молекул ДНК, способных реплицироваться независимо от бактериальной хромосомы, – внедряться в хромосому бактериальной клетки, а затем спонтанно или под воздействием индуцирующих агентов, например УФ-излучения, снова переходить в цитоплазму, захватывая при этом прилегающие гены хромосомы клетки-хозяина. В цитоплазме эти гены реплицируются (размножаются) в составе захвативших их плазмид. Фрагмент генетического материала хромосомы бактериальной клетки может быть отделен от плазмиды. Использование плазмид позволяет получать в изолированном виде практически любые бактериальные гены.
Успеху генетической инженерии способствовала разработка техники объединения генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК. Решающим в конструировании таких гибридных, или рекомбинантных, молекул in vitro явилось обнаружение и получение особых ферментов – рестриктаз, которые сейчас служат основным инструментом Г. и. Рестриктаза «разрезает» молекулу ДНК в участке (сайте), строго определенном для каждой конкретной рестриктазы. К середине 80-х гг. XX в. в мировой коллекции рестриктаз насчитывалось более 400 ферментов, «узнающих» около 100 различных по структуре участков в молекулах ДНК. С помощью рестриктаз стало возможным выделение практически любого гена в виде одного или нескольких фрагментов ДНК.
Появилась возможность снабжать синтезированные, «сконструированные» и природные гены различными регуляторными нуклеотидными последовательностями, заменять, вставлять, удалять нуклеотиды в строго заданных участках гена, укорачивать или достраивать его. Для создания гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК полученные фрагменты соединяют с ДНК вектора. С этой целью используют фермент, соединяющий фрагменты ДНК. Функциональную полноценность гибридной молекулы ДНК определяют с помощью ее переноса в клетку-реципиент по последующему размножению в ней (амплификации) и функционированию. Перенос чужеродного генетического материала в реципиентные клетки и его размножение в них обеспечивает векторная часть гибридной молекулы, а синтез специфического белка – встроенный фрагмент.
Прогресс генетической инженерии во многом обусловлен получением новых специализированных векторов. Для клонирования (размножения) сравнительно небольших фрагментов ДНК длиной до 10 тыс. пар нуклеотидов используют плазмидные векторы. Фрагменты ДНК длиной до 10-25 тыс. пар нуклеотидов клонируют с помощью векторов, полученных на основе фага лямбда. Гибридный геном такого фага, содержащий фрагмент чужой ДНК, искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Гибридный фаг при размножении лизирует клетку, образуя несколько тысяч копий, которые выделяются в культуральную среду. Для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35-45 тыс. пар нуклеотидов используют космидные векторы, представляющие собой гибрид фага лямбда и плазмиды. Космиды содержат так называемые COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий космидным векторам размножаться в бактериях, не лизируя их. Для клонирования небольших фрагментов ДНК длиной до 300-400 пар нуклеотидов в качестве векторов используют производные геномов фагов с однонитевой молекулой ДНК. Вектор, несущий чужеродную ДНК, вводят в бактериальную клетку, где эти гибридные фаги размножаются, не лизируя клетку-хозяина, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусные частицы с однонитевой молекулой ДНК.
Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующей клонированной ДНК-копии (кДНК), получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней – о характере аномалий в клонированном генетическом материале, следствием которых и является это заболевание. Созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Клонировано и в той или иной мере изучено около 1000 генов и других последовательностей нуклеотидов ДНК человека[6] .
Возможности генетической инженерии не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто необходимо обеспечить экспрессию гена в клетке, т.е. реализовать заключенную в нем генетическую информацию. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то достаточно выделить ген с его собственными регуляторными элементами, контролирующими экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, например, экспрессии гена высших организмов в клетках Е, coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена.
Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы BAL31, которая обладает уникальным свойством удалять с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» которых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи. Затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область гена высшего организма (эукариотического гена) с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов. В качестве реципиентов эффективно используют не только бактериальные клетки, но и клетки высших организмов[7] .
С помощью методов генетической инженерии были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, которые являются причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так называемый блот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают расщеплению рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза. Однотипные фрагменты ДНК инкубируют с ранее клонированным геном (или его частью) либо с полученной путем химического синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащих радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, которые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов/
Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или в близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов. Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при расщеплении этими ферментами молекула ДНК распадается на ряд фрагментов различной длины (так называемые рестрикционные фрагменты). Перестройка структуры ДНК, в результате которой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания». приводит к изменению набора этих фрагментов, т.е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике.
Генетическая инженерия положила начало новому направлению исследований, получившему название «генетика наоборот». Традиционный генетический анализ проводят в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке. Из набора клонированных участков генома (или кДНК) с неизвестной функцией, характеризующихся определенным ПДРФ, выделяют те из них, которые наиболее тесно сцеплены с конкретным признаком. Если признаком является наследственное заболевание, с помощью выявления тесно сцепленного с ним полиморфного фрагмента можно осуществить диагностику этого заболевания по наличию той или иной формы ПДРФ. Этот подход позволил разработать методы ранней пренатальной диагностики, выявления носителей патологического гена в семьях даже для таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшенна, муковисцидоз, природа генетических дефектов при которых была абсолютно не известна. Затем можно точно определить положение соответствующего гена на хромосоме, выделить и проанализировать не только ген, но и продукты его так называемой экспрессии (мРНК и белок) в норме и при патологии. Полностью принципиальная схема «генетики наоборот» успешно реализована в случае болезни Дюшенна, муковисцидоза.
На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в генетической инженерии, еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.
Практическое значение генетической инженерии для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов у человека, создания и использования микроорганизмов, потерявших свою патогенность, но сохранивших способность к формированию иммунитета. Разработаны методы синтеза антибиотиков, аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов и т.д., основанные на использовании микроорганизмов, включивших соответствующие гены.
Генетическая инженерия позволяет не только копировать природные соединения и процессы, но и модифицировать их, делать их более эффективными. Примером этого может служить новое направление исследований, названное белковой инженерией. Расчеты, производимые на основании данных об аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул белков, показывают, что при определенных заменах некоторых аминокислотных остатков в молекулах ряда ферментов возможно значительное усиление их ферментативной активности. В изолированном гене, кодирующем синтез конкретного фермента, методами генетической инженерии проводят строго контролируемую замену определенных нуклеотидов. При синтезе ферментного белка под контролем такого модифицированного гена происходит заранее спланированная замена аминокислотных остатков в полипептидной цепи, что вызывает повышение ферментативной активности модифицированного фермента во много раз по сравнению с активностью природного прототипа.
Из практических достижений генетической инженерии наиболее важными являются создание продуцентов биологически активных белков – инсулина, интерферона, гормона роста и др., а также разработка способов активизации звеньев обмена веществ, которые связаны с образованием низкомолекулярных биологически активных соединений. Таким путем получены продуценты ряда антибиотиков, аминокислот, витаминов, во много раз более эффективные, чем их продуценты, выведенные традиционными методами генетики и селекции, генетической инженерии , разрабатываются способы получения чисто белковых вакцин против вирусов гепатита, гриппа, герпеса, ящура, реализована идея использования для вакцинации комбинированного вируса осповакцины, в геном которого встроены гены, кодирующие синтез белков других вирусов (например, вирусов гепатита или гриппа). В результате прививки таким вирусом организм получает возможность выработать иммунитет не только против оспы, но и против гепатита, гриппа или другого заболевания, вызываемого тем вирусом, синтез белка которого котируется встроенным геном.
Как и любое достижение науки, успехи генетической инженерии могут быть использованы не только на благо, но и во вред человеку. Специально проведенные исследования показали, что опасность неконтролируемого распространения гибридных (рекомбинантных) ДНК не так велика, как представлялось ранее.
Гибридные ДНК и несущие их бактерии оказались очень неустойчивыми к влияниям окружающей среды, нежизнеспособными в организме человека и животных при случайном проникновении. Известно, что в природе и без вмешательства человека имеются условия, которые обеспечивают обмен генетической информацией (так называемый поток генов). Однако на пути случайного проникновения в организм чужеродной генетической информации природа создала много эффективных барьеров. При работе с большинством гибридных молекул ДНК вполне достаточно обычных мер предосторожности, которые применяют, например, микробиологи при работе с инфекционным материалом. Для особых случаев разработаны эффективные способы биологической защиты и физической изоляции экспериментальных объектов от человека и окружающей среды.
РНК имеет две формы: транспортную (тРНК) и рибосомную (рРНК). Они имеют довольно сложную структуру. Третья форма – это информационная, или матричная, РНК (мРНК). Все эти формы участвуют в синтезе белка. МРНК – это одноцепочная молекула, образующаяся на одной из цепей ДНК в процессе транскрипции. При синтезе мРНК копируется только одна цепь молекулы ДНК. Нуклеотиды, из которых синтезируются мРНК, присоединяются к ДНК в соответствии с правилами спаривания оснований и при участии фермента РНК – полимеразы. Последовательность оснований в мРНК представляет собой комплиментарную копию цепи ДНК – матрицу. Длина ее может быть различной в зависимости от длины полипептидной цепи, которую она кодирует. Большинство мРНК существует в клетке в течение короткого времени.
Рибосомная РНК кодируется особыми генами, находящимися в нескольких хромосомах. Последовательность в рРНК сходная у всех организмов. Она содержится в цитоплазме, где образует вместе с белковыми молекулами клеточные органеллы, называемые рибосомами. На рибосомах происходит синтез белка. Здесь “код”, заключенный в мРНК, транслируется в аминокислотную последовательность строящейся полипептидной цепи. Группы, образуемые рибосомами – полирибосомы (полисомы) – делают возможным одновременный синтез нескольких молекул полипептидов при участии одной молекулы мРНК.
Механизм, благодаря которому генетическая информация ДНК "транскрибируется" в матричную РНК, а затем транслируется в белок, выяснился через несколько лет после того, как молекулярные биологи осознали, что нуклеотидные последовательности в ДНК генов прямо ответственны за аминокислотные последовательности белка. Тот факт, что некоторые вирусы растений и животных содержат в качестве генетического материала РНК и что вирусная РНК сама по себе инфекционна, уже говорит о вероятной промежуточной роли РНК в переносе генетической информации.
Когда Жакоб и Моно предсказали существование короткоживущего, нестойкого посредника между генами и аппаратом белкового синтеза, поиски молекулы РНК с такими свойствами были уже начаты[8] . Первые указания на наличие фаговой РНК, которая вновь синтезировалась после фаговой инфекции и была ассоциирована с предсуществовавшими бактериальными рибосомами. Окончательное доказательство роли м РНК в синтезе полипептидов было получено в опытах с бесклеточной белок-синтезирующей системой. Экстракты нормальных клеток Е coli могли быть запрограммированы для синтеза специфических белков фага F 2 добавлением РНК из этого фага.
В дальнейшем мРНК была идентифицирована и изучена как в бактериальных, так и в животных клетках. Позже было показано, что многие молекулы м РНК, и вирусные и невирусные, способны программировать синтез специфических белков в самых разных клеточных экстрактах. Это подтверждало, что специфичность синтеза белка в различных системах зависит от м РНК, а не от системы, синтезирующей белок. Во всех клетках первым этапом экспрессии генов оказалась "транскрипция" ДНК с образованием соответствующей мРНК.
Одной из характерных особенностей антибиотиков является избирательность действия – каждый антибиотик действует на определенный набор видов микроорганизмов, т. е. имеет свой специфический антимикробный спектр действия организмов.
Продуцирование антибиотиков – один из факторов, дающий определенные преимущества микроорганизму-антагонисту в борьбе за существование в сложных естественных микробных ассоциациях. Согласно другой точке зрения, антибиотики представляют собой «отбросы» обмена веществ у микроорганизма, не играющие приспособительной, эволюционной роли. Эта точка зрения разделяется 3. Ваксманом, X. Лешевалье и некоторыми другими зарубежными исследователями[9] . Свою трактовку они обосновывают главным образом тем, что, во-первых, антибиотики образуются не всеми широко распространенными микробами; во-вторых, антибиотики быстро инактивируются в почве. Но продуцирование антибиотиков — лишь одно из приспособлений, выработанное микробами в борьбе за существование. Антагонизм микробов может обусловливаться и рядом других веществ, помимо антибиотиков, а также приспособительными механизмами, не связанными с образованием каких-либо химических соединений. Все это также может способствовать широкому распространению микробов, у которых не выявлена способность синтезировать антибиотики. К этому же следует добавить, что в лабораторных условиях, когда тот или иной актиномицет выращивают изолированно (вне естественного микробного сообщества) на искусственных питательных средах, не всегда удается выявить способность к синтезу антибиотика. То есть неактивные в лабораторных условиях штаммы актино-мицетов способны к биосинтезу антибиотиков.
Согласно международному определению «микроорганизм считается резистентным к антибиотику, если он имеет механизмы защиты к данному препарату и при лечении инфекций, вызванных этим возбудителем, нет клинического эффекта даже при использовании максимальных доз антибиотика.
Различают природную и приобретенную резистентность. Природная – это генетически обусловленное отсутствие чувствительности микроорганизма к антибактериальным средствам. Например, вирусы генетически не чувствительны к антибиотикам, большинство грамотрицательных бактерий – к пенициллину, анаэробных – к цефалоспоринам I поколения. Приобретенная резистентность возникает вследствие мутации отдельных штаммов бактерий и селекции устойчивых клонов микроорганизмов или в результате внехромосомного (плазмидного) обмена генетической информации между бактериями.
Проблема резистентности к антибиотикам достигла глобального масштаба. С ней связаны неудачи в лечении различных инфекций. Резистентность к антибиотикам приводит к увеличению смертности, значительному повышению расходов на лечение.
По данным статистики, в России резистентность бета1гемолитического стрептококка к тетрациклину составляет 46, 6%, к макролидным антибиотикам – около 12%. К комбинации сульфаметоксазола и триметоприма устойчивы 32, 4% пневмококков, к тетрациклину – 27, 1%.
В Европе, по данным авторитетного мониторингового документа Alexander Project (1998n2000), резистентность S.рneumoniae к пенициллину составляет 18, 2%, кларитромицину – 24, 1%. Результаты собственных исследований свидетельствуют о том, что устойчивость к цефазолину S. рneumoniae, выделенного у больных пульмонологического отделения в 2000n2001 гг. (г. Винница), составила 39, 2%, доксициклину o 42, 3%[10] .
Что же приводит к развитию резистентности? Наиболее весомой причиной является нерациональная антибиотикотерапия, а также применение антибактериальных препаратов при вирусных инфекциях, гриппе, назначение антибиотиков в низких дозах, короткими курсами, частая их смена. Часто неправильное назначение антибиотиков объясняется тем, что врачи не знают механизма их действия.
Большой «вклад» в развитие антибиотикорезистентности вносит неграмотное самолечение больных. Несмотря на то, что антибиотики следует отпускать только по рецептам, в аптеках их продают по требованию клиента. Определенную лепту в развитие антибиотикорезистентности вносит их использование в животноводстве и сельском хозяйстве.
На современном этапе развития медицины существуют два пути преодоления антибиотикорезистентности.
Первый – это создание принципиально новых лекарственных средств – дорогостоящий и длительный. Второй – это усовершенствование уже имеющихся антибиотиков с учетом причин и механизмов, которые привели к потере чувствительности к тем или иным микроорганизмам. Один из наиболее удачных проектов – создание около 30 лет тому назад защищенных аминопенициллинов. Долгое время они были препаратами № 1 в борьбе с инфекционными заболеваниями. Но многие микробы к ним приспособились и стали вырабатывать бета-лактамазу – фермент, разрушающий аминопенициллины. В ответ на это к «молекуле» аминопенициллина присоединили клавулановую кислоту. Получился уникальный антибиотик Аугментин (амоксициллин/клавулановая кислота). Бета1лактамазы, соединяясь с клавулановой кислотой, теряют свою разрушающую способность. Практически фермент полностью нейтрализуется этой кислотой, а амоксициллин беспрепятственно выполняет свою благородную миссию – уничтожает патогены. Аугментин (амоксициллин/клавулановая кислота) является самым назначаемым антибиотиком в мире. Это препарат № 1 при лечении пневмонии, обострений хронической обструктивной болезни легких, отита, синусита. Большинство микробов, несмотря на свою изобретательность, так и не смогли защититься от этого препарата, и резистентность к нему минимальная.
К числу наиболее актуальных задач в разработке проблемы антибиотиков сегодня относятся: создание и разработка способов преодоления антибиотикорезистентности микробов; изыскание природных и создание полусинтетических антибиотиков, эффективных в борьбе со стафилококковой, синегнойной и другими инфекциями, злокачественными опухолями; поиски новых продуцентов среди малоизученных групп организмов; изучение генетических рекомбинаций у микроорганизмов с продукцией новых антибиотиков; получение новых антибиотиков путем направленного биосинтеза и подбора соответствующих мутантов и рекомбинантов.
Антибиотики – вещества, избирательно подавляющие жизнеспособность микроорганизмов. По спектру действия антибиотики разделяются на антибактериальные, противогрибковые и противоопухолевые. Среди первых различают следующие основные группы: пенициллин и цефалоспорины, антибиотики, действующие преимущественно на грамположительные формы микробов, антибиотики – амипогликозиды, тетрациклины, левомицетины. По характеру действия антибиотиков па бактерии их можно разделить на две группы: бактериостатического и бактерицидного действия. По молекулярному механизму действия антибиотики можно разделить на следующие группы. Ингибирующие синтез бактериальной оболочки клетки (пенициллины, ристомицин, новобиоцин и др.). Нарушающие синтез белков в бактериальной клетке (тетрациклины, левомицетин и др.). Подавляющие синтез белков в бактериальной клетке и одновременно подавляющие генетический аппарат клетки (аминогликозиды). Угнетающие синтез нуклеиновых кислот в клетках (противоопухолевые антибиотики). Нарушающие целостность цитоплазматической мембраны (противогрибковые антибиотики).
Полусинтетический антибиотик semi-synthetic antibiotic – природный антибиотик, модифицированный в лабораторных условиях с целью повышения его стабильности. Полусинтетические антибиотики разработаны путем частичного изменения химической структуры природных антибиотиков. Особенно большие успехи достигнуты в получении полусинтетических пенициллинов. Полусинтетические пенициллины способны выдержать долгое хранение, при использовании их достигается постоянный уровень их в крови, отсутствует или очень медленно появляется резистентность микробной флоры, не вызывают явлений авитаминоза, не обладают токсическим действием.
5. Использование антибиотиков в качестве лекарственных средств.
Народной медицине давно были известны некоторые способы применения в качестве лечебных средств микроорганизмов или продуктов их обмена, однако причина их лечебного действия в то время оставалась неизвестной. Например, для лечения некоторых язв, кишечных расстройств и других заболеваний в народной медицине применялся заплесневевший хлеб.
В 1871–1872 гг. появились работы русских исследователей В. А. Манассеина и А. Г. Полотебнова, в которых сообщалось о практическом использовании зеленой плесени для заживления кожных язв у человека. Первые сведения об антагонизме бактерий были обнародованы основоположником микробиологии Луи Пастером в 1877 г. Он обратил внимание на подавление развития возбудителя сибирской язвы некоторыми сапрофитными бактериями и высказал мысль о возможности практического использования этого явления.
С именем русского ученого И. И. Мечникова (1894) связано научно обоснованное практическое использование антагонизма между энте-робактериями, вызывающими кишечные расстройства, и молочнокислыми микроорганизмами, в частности болгарской палочкой («мечниковская простокваша»), для лечения кишечных заболеваний человека.
Русский врач Э. Гартье (1905) применил кисломолочные продукты, приготовленные на заквасках, содержащих ацидофильную палочку, для лечения кишечных расстройств. Как оказалось, ацидофильная палочка обладает более ярко выраженными антагонистическими свойствами по сравнению с болгарской палочкой.
В конце XIX – начале XX в. были открыты антагонистические свойства у спорообразующих бактерий. К этому же периоду относятся первые работы, в которых описываются антагонистические свойства у актиномицетов. Позднее из культуры почвенной спороносной палочки Bacillus brevis Р. Дюбо (1939) удалось выделить антибиотическое вещество, названное тиротрицином, которое представляло собой смесь двух антибиотиков – тироцидина и грамицидина. В 1942 г. советскими исследователями Г.Ф. Гаузе и М. Г. Бражниковой был выделен из подмосковных почв новый штамм Bacillus brevis, синтезирующий антибиотик грамицидин С, отличающийся от грамицидина Дюбо.
В 1939 г. Н. А. Красильников и А. И. Кореняко из культуры фиолетового актиномицета Actinomyces violaceus, выделенного ими из почвы, получили первый антибиотик актиномицетного происхождения – мицетин – и изучили условия биосинтеза и применения мицетина в клинике.
А. Флеминг, изучая стрептококков, выращивал их на питательной среде в чашках Петри. На одной из чашек вместе со стафилококками выросла колония плесневого гриба, вокруг которой стафилококки не развивались. Заинтересовавшись этим явлением, Флеминг выделил культуру гриба, определенную затем как Penicilliurn notatum. Выделить вещество, подавляющее рост стафилококков, удалось только в 1940 г. оксфордской группе исследователей. Полученный антибиотик был назван пенициллином.
С открытия пенициллина началась новая эра в лечении инфекционных болезней – эра применения антибиотиков. В короткий срок возникла и развилась новая отрасль промышленности, производящая антибиотики в крупных масштабах. Теперь вопросы микробного антагонизма приобрели важное практическое значение и работы по выявлению новых микроорганизмов – продуцентов антибиотиков стали носить целенаправленный характер.
В СССР получением пенициллина успешно занималась группа исследователей под руководством 3. В. Ермольевой. В 1942г. был выработан отечественный препарат пенициллина. Ваксманом и Вудрафом из культуры Actinomyces antibioticus был выделен антибиотик актиномицин, который впоследствии стал использоваться как противораковое средство. Первым антибиотиком актиномицетного происхождения, нашедшим широкое применение особенно при лечении туберкулеза, был стрептомицин, открытый в 1944 г. Ваксманом с сотрудниками. К противотуберкулезным антибиотикам относятся также открытые позже вио-мицин (флоримицин), циклосерин, канамицин, рифамицин.
В последующие годы интенсивные поиски новых соединений привели к открытию ряда других терапевтически ценных антибиотиков, нашедших широкое применение в медицине. К ним относятся препараты с широким спектром антимикробного действия. Они подавляют рост не только грамположительных бактерий, которые более чувствительны к действию антибиотиков (возбудители пневмонии, различных нагноений, сибирской язвы, столбняка, дифтерии, туберкулеза), но и грамотрицательных микроорганизмов, которые более устойчивы к действию антибиотиков (возбудители брюшного тифа, дизентерии, холеры, бруцеллеза, туляремии), а также риккетсий (возбудители сыпного тифа) и крупных вирусов (возбудители пситтакоза, лимфогрануломатоза, трахомы и др.). К таким антибиотикам относятся хлор-амфеникол (левомицетин), хлортетрациклин (биомицин), окситетрациклин (террамицин), тетрациклин, неомицин (колимицин, мицерин), канамицин, паромомицин (мономицин) и др. Кроме того, в распоряжении врачей в настоящее время имеется группа антибиотиков резерва, активных в отношении устойчивых к пенициллину грамположительных болезнетворных микроорганизмов, а также противогрибные антибиотики (нистатин, гризеофульвин, амфотерицин В, леворин)[11] .
В настоящее время число известных антибиотиков приближается к 2000, однако в клинической практике используется всего около 50.
6. Производство столбнячного анатоксина.
Столбнячный анатоксин применяют с профилактической целью против заболевания животных столбняком. Концентрированный столбнячный анатоксин представляет собой преципитат 1-процентного квасцового анатоксина, изготовляемого из нативного столбнячного токсина. По внешнему виду анатоксин представляет жидкость прозрачно-желтого цвета с рыхлым осадеом на дне ампулы. При взбалтывании ампулы осадок легко разбивается в равномерную взвесь, придавая анатоксину беловато-желтоватый цвет. На каждой коробке с анатоксином должна быть этикетка с указанием наименования и товарного знака предприятия-изготовителя, наименование препарата, количества анатоксина в ампуле, номера серии и контроля, даты изготовления, дозы, срока годности, условий хранения, обозначения ГОСТа.
Ампулы с анатоксином, содержащие плесень, неразбивающийся осадок и посторонние примеси, без этикетки, а также плохо укупоренные, выбраковывают. Анатоксин, не использованный в день открытия ампулы, обезвреживается кипячением в течение 15 минут.. Срок годности анатоксина 3 года при условии хранения в сухом, темном помещении при температуре от 2 до 15°С. Анатоксин, подвергшийся замораживанию, к применению не пригоден.
Анатоксин применяют в дозе 1 куб.см для крупных животных и 0, 5 куб.см – для молодняка и мелких животных. Анатоксин вводят подкожно, в средней части верхней трети шеи животного, однократно. Иммунитет наступает через 30 дней после прививки и сохранятся у лошадей в течение 5 лет, а у остальных животных – свыше одного года.
Анатоксин столбнячный адсорбированный - препарат состоит из очищенного столбнячного анатоксина и геля гидроокиси алюминия. Консервант - мертиолят в концентрации 0, 01 %. В 1мл содержится 20 единиц связывания (ЕС) анатоксина.
Анатоксин столбнячный представляет собой суспензию желтовато-белого цвета, при стоянии разделяющуюся на рыхлый осадок и прозрачную надосадочную жидкость. Осадок легко разбивается при встряхивании[12] .
Адсорбированный столбнячный анатоксин при введении в организм вызывает образование антитоксина.
Полный курс иммунизации, включающий вакцинацию и ревакцинацию, создает у привитых надежную защиту против столбняка. Препарат предназначен для активной иммунизации против столбняка в рамках плановой и экстренной профилактики.
7. Получение гамма-интерферона.
Гамма-интерферон человека (hIFN-g) – иммуномодулятор, обладающий антивирусным и антипролиферативным действием. hIFN-g – гликопротеин, секретируемый Т-лимфоцитами и моноцитами. Один из путей получения гликозилированного hIFN-g в промышленных масштабах состоит в создании трансгенных животных, синтезирующих hIFN-g в молочной железе и секретирующих его в молоко[13] .
На основе регуляторных последовательностей гена b-лактоглобулина овцы (BLG) и транскрипционной единицы гена g-интерферона человека (hIFN-g) сконструирован гибридный ген BLG-hIFN-g. Этот ген был использован для создания трансгенных мышей. Показано, что hIFN-g эффективно экспрессировался в молочной железе таких мышей (до 570 мкг/мл молока), гликозилирован и обладает биологичской активностью. Проводятся работы по созданию трансгенных кроликов-продуцентов hIFN-g.
Получено несколько животных, содержащих ген hIFN-g в составе своего генома. По литературным данным потребность в этом препарате в России составляет ~100 г/год. Таким образом, небольшое стадо кроликов (~100 голов) может обеспечить потребности всей страны в hIFN-g. g-Интерферон человека важен для практического здравоохранения, так как через него осуществляется Т-хелперный контроль функции макрофагов и цитолитических эффекторов иммунитета. Введение этого цитокина способствует восстановлению фагоцитарной цитолитической функции и повышает иммунную защиту организма.
При инфекциях, вызванных простейшими (лейшманиоз, хламидиоз, малярия), при которых роль макрофагов в процессах выздоровления велика, hIFN-g представляется особенно перспективным. Эффективность препарата кажется вероятной при иммунокомплексной патологии (артриты, системная красная волчанка), также связанной с функцией макрофагов. Так как hIFN-g участвует в регуляции ранних этапов гемопоэза, он будет полезен также при комплексной терапии гемобластозов (лейкозов, лейкемий, лимфом), связанных с нарушением ранних стадий дифференцировки предшественников.
Гамма-интерферон применяют для коррекции нарушений клеточного иммунитета, а также для лечения инфекционных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний.
8. Неорганические носители, используемые для иммобилизации ферментов. Их характеристика.
В последние 15–20 лет на стыке ряда химических и биологических дисциплин сложилось новое "инженерное" направление – химическая энзимология, стремительное развитие которой было обусловлено созданием биологических катализаторов нового типа – иммобилизованных ферментов. А разработка метода иммобилизованных ферментов определялась, в свою очередь, рядом существенных факторов, затрудняющих использование чистых ферментов во многих промышленных производствах.
Во-первых, чистые препараты ферментов неустойчивы при длительном хранении, а также при разного рода воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, в виду сложности отделения ферментов от различных реагентов смеси многократное их использование весьма затруднено.
Однако принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией с разработкой принципов создания иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании в прикладных (промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко отделить от реакционной среды, что обусловливает[14] :
• возможность остановки реакции в любой нужный момент;
• повторное использование катализатора;
• получение конечного продукта, не загрязненного ферментом.
Последний момент весьма важен при производстве пищевых и медицинских продуктов. Применение иммобилизованного катализатора позволяет проводить ферментный процесс непрерывно и регулировать скорость реакции, а также изменять количество получаемого продукта в соответствии с изменениями скорости протока реакционной смеси.
Иммобилизация или некоторая модификация фермента может обусловить изменения и некоторых его свойств (специфичность взаимодействия с субстратом; зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, а также его стабильность по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям).
Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность за счет изменения свойств носителя. Для иммобилизации ферментов используются также различные типы неорганических носителей, таких, как создаваемые на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов.
Основными качествами, определяющими широкое внедрение неорганических носителей в производственные процессы, является легкость их регенерации и возможность придания им любой конфигурации. Они могут применяться как в виде порошков, шариков, так и монолитов; они могут быть как пористыми, так и сплошными (непористыми).
Определенное преимущество для различного рода работ имеют носители, приготавливаемые на основе микропористых кремнеземов. К их достоинствам следует отнести механическую прочность, химическую инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, а также устойчивость к микроорганизмам. Недостатками кремнеземов является их использование в ограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции на их поверхности, хотя последнее может быть устранено различными модифицирующими воздействиями. Правда, стоимость кремнеземных носителей относительно высока, и модификация еще больше повышает цену, поэтому внедрение их в промышленность существенно ограничено.
Более пригодными для промышленного использования могут оказаться природные алюмосиликаты – глины, а также пористая керамика, в состав которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана, циркония или другие добавки. Следует также упомянуть такие широко распространенные носители, как уголь и графитированная сажа. Весьма перспективными носителями являются приготавливаемые на основе металлов и их оксидов, которые характеризуются высокой механической прочностью, относительной дешевизной, стабильностью и хорошими гидродинамическими свойствами.
Иммобилизация представляет собой включение u1092 фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы:
• адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как иногда говорят матрикса);
• включение в поры геля;
• пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;
• введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.
Как и всякая другая классификация, приведенная ниже, является в значительной степени условной, так как не всегда существует возможность проведения четкой границы между различными способами иммобилизации.
Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих в настоящее время способов иммобилизации ферментов. Носителями при данном способе иммобилизации могут быть как органические, так и неорганические вещества, которые применяются а виде порошка, мелких гранул или шариков. Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях отличается исключительной простотой и достигается путем обеспечения контакта водного раствора фермента с избранным для конкретной цели носителем.
После отмывки неадсорбированного фермента препарат готов к применению.
На процесс адсорбции и прочность связывания фермента с носителем оказывают определенное влияние различные факторы внешней среды, основными из которых являются: удельная поверхность и пористость носителя, значения рН среды, ионная сила раствора фермента, его концентрация, а также температура проведения адсорбции.
Иными словами, эффективность иммобилизации ферментов определяется сбалансированностью ряда факторов и нарушение этого u1073 баланса может привести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носителем. Для исключения подобной ситуации, на практике используется набор методических приемов, способствующих повышению эффективности процесса и, следовательно, получению более качественных препаратов.
Иммобилизация путем включения в гели состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку, образованную тесно переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой приходится обычно значительная часть общего объема геля.
Для иммобилизации фермента в геле существует два основных способа:
• при одном из них фермент вводится в водный раствор мономера, а затем уже проводят полимеризацию, в результате которой формируется гель с включенными в него молекулами фермента;
• второй способ состоит в том, что фермент вносится в раствор уже готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в требуемое состояние, гелеобразное состояние.
Иммобилизация путем включения в полупроницаемые мембраны –состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, способной легко пропускать небольшие молекулы субстрата, задерживая крупные молекулы фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемых мембран и их природой.
К этим модификациям относятся: микрокапсулирование в замкнутых сферических пузырьках, имеющих тонкую полимерную стенку (мембрану).
Метод двойного эмульгирования, в соответствии с которым приготовленная заранее эмульсия водного раствора фермента в органическом растворе полимера вновь диспергируется в воде. После затвердевания органического раствора образуются полимерные сферические частицы с иммобилизованными в них молекулами фермента.
Способ включения в волокна отличается от метода микрокапсулирования главным образом формой получаемых препаратов. Если при микрокапсулировании образуются сферические микрокапсулы, то при этом способе формируются нити. Для иммобилизации ферментов можно использовать также выпускаемые промышленностью полимерные полые волокна, изготавливаемые из природных или синтетических материалов. Для проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует раствор фермента, погружаются в сосуд с раствором субстрата, диффундирующим через мембрану внутрь волокна.
В медицинских целях и некоторых фундаментальных исследованиях достаточно широко используется метод иммобилизации ферментов путем их включения в липосомы, поскольку такие системы близки природным мембранам и могут дать весьма ценную информацию о ферментативных процессах, протекающих в клетках. Существует несколько модификаций данного способа, самой последней из которых является иммобилизация путем включения в полимерные липосомы. Полимерные липосомы характеризуются более высокой стабильностью по сравнению с обычными.
Основным недостатком всех мембранных систем, применяемых для иммобилизации ферментов, является невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембраны представляют собой непреодолимые барьеры.
Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа сводится к тому, что ограничение свободы перемещения фермента в системе достигается не вследствие его фиксирования на жестком носителе, а в результате его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что вследствие химических взаимодействий в молекуле фермента возникают новые ковалентные связи, в частности между ним и носителем[15] . Препараты иммобилизованных ферментов, получаемые с использованием химических методов, обладают, по крайней мере, двумя существенными достоинствами. Во-первых, формирующаяся ковалентная связь между ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующих конъюгатов. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств (субстратной специфичности, каталитической активности и стабильности).
Существует большое число химических реакций, используемых для ковалентного связывания ферментов с неорганическими носителями (такими, как керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природными полимерами (такими, как сефароза и целлюлоза), а также синтетическими полимерными веществами (нейлон, полиакриламид и другие виниловые полимеры или сополимеры, обладающие реакционно-способными группами).
Во многих из этих процедур ковалентное связывание ферментов с носителем является не специфичным, т. е. ассоциирование фермента с носителем осуществляется за счет химически активных группировок фермента, распределенных по его молекуле случайным образом.
Основным является создание техники конъюгирования, при которой ферменты связывались бы с носителем достаточно эффективно, но без снижения их каталитической активности. Короче говоря, химическая иммобилизация ферментов в целом является своеобразным искусством, уровень которого определяется качествами экспериментатора.
Для получения иммобилизованных ферментов используют большое количество различных как органических, так и неорганических носителей.
Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут служить для иммобилизации ферментов, следующие:
• высокая химическая и биологическая стойкость;
• высокая механическая прочность;
• достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная поверхность, высокая пористость;
• возможность получения трубок, листов и т.п.;
• легкая активация (переведение в реакционноспособную форму);
• высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции связывания с ферментом в водной среде;
• невысокая стоимость.
Отсутствие в природе универсальных носителей, обладающих сразу всеми перечисленными свойствами, обусловливает широкий набор применяемых для иммобилизации ферментов материалов.
Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика, т. 1–2, пер. с англ. – М.: 2000.
Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. – М.: "Мир", 2002.
Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. – М.: "Агропромиздат", 1990.
Биотехнология // Под ред. А.А. Баева. – М.: 2002.
Биотехнология, в 8-ми томах // Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. – М.: "Высшая школа", 2005.
Биотехнология. Принципы и применение // Под ред. И. Хиггинса и др., пер. с англ. – М.: 2003.
Бочков Н.П., Захаров А.Ф., Иванов В.И. Медицинская генетика. – М.: 2001.
Статьи и монографии сайта // http://www.helpeducation.ru
Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: биотехнологические агенты, технология, аппаратура. – Рига: "Зинатне", 2005.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. – М.: «Мир», 2002.
Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: 1999.
Гриневич А.Г., Босенко А.М. Техническая микробиология. – СПб.: 2001.
Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.
Маниатис Г., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование (методы генетической инженерии), пер. с англ. – М.: 2001.
Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: "Просвещение", 2000.
Сельскохозяйственная биотехнология. Учебное пособие // Под ред. В.С. Шевелуха. – М.: «Высшая школа», 2003.
Синклер М., Берг П. Гены и геномы. – М.: «Мир», т.1, 2, 2001.
Уотсон Дж., Туз Дж., Кури Ц. Рекомбинантные ДНК, пер. с англ. – М.: 1999.
Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – М.: 2004.
Работа предоставлена пользователем Student.km.ru.
[1] Биотехнология. Принципы и применение // Под ред. И. Хиггинса и др., пер. с англ. – М.: 2003.
[2] Биотехнология // Под ред. А.А. Баева. – М.: 2002.
[3] Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. – М.: "Агропромиздат", 1990.
[4] Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: биотехнологические агенты, технология, аппаратура. – Рига: "Зинатне", 2005.
[5] Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. – М.: "Мир", 2002.
[6] Уотсон Дж., Туз Дж., Кури Ц. Рекомбинантные ДНК, пер. с англ. – М.: 1999.
[7] Синклер М., Берг П. Гены и геномы. – М.: «Мир», т.1, 2, 2001.
[8] Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – М.: 2004.
[9] Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.
[10] Биотехнология, в 8-ми томах // Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. – М.: "Высшая школа", 2005.
[11] Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. – М.: "Агропромиздат", 1990.
[12] Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: 1999.
[13] Биотехнология // Под ред. А.А. Баева. – М.: 2002.
[14] Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.
[15] Биотехнология. Принципы и применение // Под ред. И. Хиггинса и др., пер. с англ. – М.: 2003.